荧光PCR探针熔解曲线法检测结核分枝杆菌对利福平、异烟肼、喹诺酮及卡那霉素耐药性的评价*

刘春平, 谭耀驹, 苏碧仪, 马品云

广州市胸科医院医学检验科(广东广州 510095)

结核病是全球范围内一种重要的传染病，严重危害人类的生命健康。耐多药结核是指同时对利福平和异烟肼产生耐药，广泛耐药结核在耐多药结核基础上，对二线药物喹诺酮类以及3种二线注射药物(卷曲霉素、卡那霉素和阿米卡星)中的至少一种产生耐药。据世界卫生组织估计，2017年全球约有55.8万例耐多药结核患者，1.08万例广泛耐药结核患者[1]。耐多药结核和广泛耐药结核逐年增加，给结核病的预防和控制带来了严峻的挑战。耐药结核病治疗时间长，治愈率低，传播风险高，早期快速的诊断是合理治疗的基础，也是耐药结核病防治的关键所在。目前确诊耐多药结核需要分离结核分枝杆菌进行培养、菌种鉴定及药敏试验，传统的表型药敏试验耗时长、操作复杂，延误患者的诊断和治疗时间，因此，建立快速准确检测结核杆菌耐药性的方法才能满足临床耐多药结核诊断的需求。随着分子生物学技术的飞速发展，耐药结核病的相关基因快速诊断技术也随之被使用。2011年WHO推荐Xpert MTB/RIF技术用于结核的快速诊断和利福平耐药性检测[2]，但成本高且只能检测利福平单一耐药性。本研究采用荧光PCR熔解曲线方法检测治疗结核分枝杆菌一线药物利福平和异烟肼以及二线药物喹诺酮和卡那霉素的耐药突变，并与表型药敏试验方法比较，以评价该方法在早期快速诊断耐多药结核和广泛耐药结核中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2013年12月至2014年3月广州市胸科医院216例涂阳肺结核患者的痰标本。男161例，女55例，年龄(50.56±17.43)岁。

1.2 方法

1.2.1 标本收集和培养 经金胺O染色证实为阳性的痰标本，加入2～3倍体积的4% N-乙酰半胱氨酸-氢氧化钠(NALC-NaOH)，液化15min。将液化后的痰标本分成两份，一份用于DNA提取，一份用于分离培养。分离培养按照中国防痨协会《结核病诊断实验室检验规程》使用BACTEC MGIT960全自动分枝杆菌培养仪进行[3]。

1.2.2 结核分枝杆菌菌种鉴定和药敏试验 对分离培养出的阳性产物按照中国防痨协会《结核病诊断实验室检验规程》实验操作方法进行结核分枝杆菌菌种鉴定和利福平、异烟肼、喹诺酮和卡那霉素药敏试验[3]。

1.2.3 结核分枝杆菌DNA的提取 取1 mL液化后的痰标本，12 000×g离心10 min，弃上清液。重悬于250 μL TB DNA提取液中，涡旋振荡混匀。封口膜封口，99℃加热10 min，12 000×g离心10 min，转移上清液至半自动核酸提取仪(厦门致善生物科技股份有限公司)进行核酸提取，提取液作为DNA模板。

1.2.4 荧光PCR熔解曲线法检测利福平、异烟肼、喹诺酮和卡那霉素耐药性 采用荧光PCR熔解曲线法(结核分枝杆菌利福平耐药突变检测试剂盒、异烟肼耐药突变检测试剂盒、喹诺酮耐药检测试剂盒和卡那霉素耐药检测试剂盒，均为厦门致善生物科技股份有限公司)检测利福平、异烟肼、喹诺酮和卡那霉素的耐药性。利福平耐药突变检测结核分枝杆菌复合群rpoB 507-534核心区位点的突变。异烟肼耐药突变检测ahpC启动子区(-44～-30、-15～3位点)、inhA94密码子、inhA启动子区(-17～-8位点)以及katG315密码子的突变。喹诺酮耐药突变检测gyrA基因88～94位密码子的突变。卡那霉素耐药突变检测rrs基因的4个位点(1401、1402、1473和1484位点)和eis基因启动子区(-10、-14和-37位点)的3个突变位点。所有的PCR反应体系均为25 μL。实验操作步骤严格按照说明书进行，并参照试剂盒说明书进行结果判读。利福平、异烟肼和卡那霉素的每个标本有两个反应管，每种突变检测FAM和TET两个通道荧光信号，即每个标本有4个通道的检测结果。而喹诺酮每个标本有一个反应管，只检测FAM一个通道荧光信号，每个标本有2个检测结果。操作流程简述如下：配制PCR反应液：取n×19.6 μL PCR Mix A和n×0.4 μL TB酶混合液加入至1.5 mL 离心管内，混匀，向每支PCR反应管内分装20 μL，再加入5 μL相应提取样品或阳/阴性对照，PCR扩增仪上进行PCR扩增和熔解分析。

1.3 统计学方法 用SPSS 21.0统计软件，以表型药敏试验为标准，计算荧光PCR探针熔解曲线法的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、符合率和Kappa值。

2 结果

2.1 液体培养和菌种鉴定结果 金胺O染色结果为阳性患者的痰标本共216份进行分离培养，7份(3.24%)污染，培养阴性的标本有12份(5.56%)，获得阳性培养菌株有197份(91.20%)。后经菌种鉴定15份(7.61%)为非结核分枝杆菌，最终获得182份(92.39%)结核分枝杆菌临床分离株。见表1。

表1 216份痰标本液体培养、菌鉴及熔解曲线法检测结果 份

2.2 药敏试验结果 182份临床结核杆菌分离株中，其中34份(18.68%)为利福平耐药株，敏感株为148株(81.32%)；53份(29.12%)为异烟肼耐药株，129份(70.88%)为敏感株；22份(12.09%)为喹诺酮耐药株，160份(87.91%)为敏感株；5份(2.75%)为卡那霉素耐药株，177份(97.25%)为敏感株。其中同时对利福平和异烟肼耐药者有33株(18.13%)，同时对利福平、异烟肼和喹诺酮耐药者有17株(9.34%)，同时对利福平、异烟肼、喹诺酮和卡那霉素4种均耐药者有1株(0.55%)。

2.3 荧光PCR熔解曲线法结果 荧光PCR探针熔解曲线法检测216份痰标本结核杆菌耐药性，15份(6.94%)检测无效，其中1份对利福平无效、1份对异烟肼无效、3份对卡那霉素无效；2份同时对利福平和异烟肼无效；2份对利福平、异烟肼和卡那霉素3种均无效；6份对利福平、异烟肼、喹诺酮和卡那霉素同时无效。检测有效的201份(93.06%)痰标本中，40份(19.90%)对利福平耐药，161份(80.10%)对利福平敏感；46份(22.89%)对异烟肼耐药，155份(77.11%)对异烟肼敏感；23份(11.44%)对喹诺酮耐药，178份(88.56%)对喹诺酮敏感；3份(1.49%)对卡那霉素耐药，198份(98.51%)对卡那霉素敏感。其中检测出36份(17.91%)同时对利福平和异烟肼耐药，15份(7.46%)同时对利福平、异烟肼和喹诺酮耐药，2份(0.99%)同时对4种抗结核药物耐药。

2.4 荧光PCR熔解曲线法敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、符合率及Kappa值 174份标本同时获得药敏试验及荧光PCR探针熔解曲线法检测利福平、异烟肼、喹诺酮和卡那霉素的耐药性结果，以表型药敏试验结果为标准，荧光PCR熔解曲线法分别检测利福平、异烟肼、喹诺酮和卡那霉素耐药的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值及符合率结果见表2。荧光PCR探针熔解曲线法与表型药物敏感度试验检测结核分枝杆菌对利福平、异烟肼、喹诺酮和卡那霉素耐药性的Kappa值分别为0.89、0.81、0.91和0.66。

表2 结核分枝杆菌对利福平、异烟肼、喹诺酮及卡那霉素药物的耐药效能

3 讨论

结核分枝杆菌具有特有的、高疏水性的细胞壁保护、外排泵以及产生β-内酰胺酶的降解酶等功能，降低某些药物的渗透而表现天然抗性[4]。它不同于其他的细菌借助质粒、转座子和整合子产生耐药，其耐药性的产生主要是由于染色体上编码药物靶点的基因或药物活性有关的酶基因特定区域的碱基突变所致。随着对耐多药结核病耐药机制的认识，各种检测结核分枝杆菌耐药基因突变的试验方法正在得到积极研制和应用。荧光PCR探针熔解曲线法是PCR和熔解曲线分析方法的结合，由于野生型序列具有自身特定的熔点，当基因突变时探针结合力下降导致熔点下降，通过监测荧光杂交信号区分出野生型与突变型。

约95%的利福平耐药菌株是由rpoB基因上81 bp的耐药决定区突变所致，突变后利福平不能与细菌RNA聚合酶的β-亚基结合，出现耐药[5]。几乎所有的利福平耐药株同时也对异烟肼耐药，因此rpoB基因的突变是耐多药结核菌株的标志，单独对利福平敏感度分析可作为耐多药的筛选指标[6]。本研究药敏试验仅发现1株利福平耐药，而异烟肼敏感现象。以表型药敏试验为标准，荧光PCR熔解曲线检测结核分枝杆菌对利福平耐药的敏感度、特异度和符合率与以往文献报道[7-10]相一致。与WHO推荐的Xpert MTB/RIF技术检测利福平耐药性的敏感度和特异度[11]相比较，该方法具有同等的检验效能。

异烟肼结构虽然简单，但耐药却是一个非常复杂的过程，约80%以上的异烟肼耐药结核杆菌发生在katG 315密码子、inhA启动子的-15和-8位或ahpC启动子区域的-6～-47位点的碱基突变[12]。以表型药敏试验为参照，荧光PCR熔解曲线检测结核分枝杆菌对异烟肼耐药的敏感度为76.00%。虽然本研究使用的试剂盒涵盖80%以上的常见结核分枝杆菌异烟肼突变位点，但仍有20%突变位点不能检测，或存在其他耐药机制以及所用的临床菌株存在差异等，这些可能是造成敏感度略低于文献报道[13]的主要原因。荧光PCR探针熔解曲线法检测异烟肼耐药的Kappa值为0.81，表明该方法与表型药敏试验具有高度的一致性。此外本研究发现荧光PCR探针熔解曲线法检测利福平或异烟肼为耐药突变，而药敏试验结果却为敏感，可能与荧光PCR探针熔解曲线法过于敏感、低水平耐药基因突变后仍对药物敏感或药敏操作中出现失误相关，但最终还需基因测序进一步验证。

目前针对一线抗结核药物利福平和异烟肼的耐药基因的研究较多，而针对二线抗结核药物喹诺酮和卡那霉素耐药分子诊断相对较少。左氧氟沙星和莫西沙星已被WHO推荐为治疗耐多药结核病的核心药物。因此针对喹诺酮耐药的检测亦很重要。喹诺酮耐药结核杆菌多发生在DNA旋转酶的gyrA基因保守区67～106位的密码子区发生突变，常见的突变有94位GAC→GCC/CAC/TAC及90位GCC→GTG[14]。本研究采用的荧光PCR探针熔解曲线法试剂盒涵盖约70%～90%的喹诺酮突变位点，以药敏试验为参照，其敏感度为85.00%，特异度为100.00%，与文献[15]报道基本一致。与药敏试验方法具有高度一致性，因此该方法在快速检测喹诺酮耐药性上具有重要的应用价值。

本研究以药敏试验为参考，荧光PCR探针熔解曲线法检测卡那霉素的特异度和符合率均很高，但敏感度和一致性均明显低于使用同样试剂盒的文献报道[16]。分析敏感度和一致性低的原因可能是本研究中182份结核分枝杆菌临床分离株中卡那霉素耐药率仅有2.75%，阳性样本数太少以及荧光PCR探针熔解曲线法检测卡那霉素无效率占66.67%，使检验效率存在严重偏倚，在今后的研究中还需扩大阳性样品数和优化该检测方法进一步评估其检验效能。

另外本研究发现液体培养污染和培阴的19例标本中，16份荧光PCR熔解曲线法检测有效。菌种鉴定为非结核分枝杆菌的15份标本中，11份荧光PCR熔解曲线法判定为有效检测，而182份检测出表型药敏试验结果的标本中有8份荧光PCR熔解曲线法却存在无效检测现象。由此可见，虽然在一定程度上荧光PCR熔解曲线法可弥补培养过程中的污染和培阴造成耐药性的漏检，但同时自身也存在一定的漏检和误判情况。

综上所述，虽然荧光PCR熔解曲线技术存在一定的局限性，但总体来讲此方法在检测结核分枝杆菌利福平、异烟肼和喹诺酮耐药性方面具有较高的敏感度和特异度，与药敏试验具有高度的一致性，并且简单快速，仅需要2～3 h即可检出多种抗结核药物的耐药性，扩增和结果判读在一个反应管内进行，成本低，生物安全性较好。因此，该方法在快速诊断耐药结核病上具有良好的应用前景，可以及时治疗和管理结核病患者，对控制耐多药结核和广泛耐药结核具有重要意义。