分子生物学检测在肺结核病精准诊断中的应用*

谭守勇

呼吸疾病国家重点实验室、广州市胸科医院结核内科(广东广州 510095)

肺结核病是重大呼吸道传染性疾病，是指发生在肺组织、气管、支气管和胸膜的结核病变。据WHO估算[1]，2019年全球约有1 000万人患结核病，其中我国约有83.3万人患结核病。其患病人数约为2020年我国新冠肺炎患病人数10倍。减少肺结核发病和死亡的关键环节是“早诊断、早隔离、早治疗”，早诊断可以减少个体治疗延误和结核分枝杆菌(MTB)在社区的传播。肺结核诊断以细菌学和分子生物学的病原学检查为主，结合流行病学、临床表现、胸部影像和相关的辅助检查等结果，通过鉴别诊断和综合分析才能明确诊断。因此，结核病的病原学检测是至关重要。由于大多数肺结核病临床表现不典型、胸部影像学表现特异性差，这可能导致肺结核病漏诊及误诊。据WHO在2020全球结核报告[1]，2019年登记590万例肺结核患者中，仅有57%经细菌学证实。我国新发及复发的病例有72.8万例，仅47%通过细菌学证实，31%采用分子生物学快速诊断方法作为诊断手段。因此，WHO呼吁各国应增加细菌学确诊病例的百分比，减少结核病漏诊率有效控制结核病疫情。

1 肺结核病病原学的诊断概况

目前肺结核病的病原学诊断在我国医疗基层单位仍以抗酸涂片镜检及分枝杆菌培养为主：(1)抗酸涂片镜检，需标本中菌量至少5 000～10 000条/mL时，结果才可呈阳性；而且由于分枝杆菌抗酸性是菌体内的分枝菌酸、RNA蛋白及其细菌细胞壁的完整性相结合的综合反应，即抗酸性的强弱与细菌细胞壁的完整性、细菌成熟和衰老程度均有关系，故抗酸涂片镜检的检出率、敏感性较低，但因其技术简单、操作性强、费用低、检测快速和能确定感染部位等优点，现仍作为临床筛查肺结核的首选检测项目。(2)分枝杆菌培养的检出率较高，但因培养时间长，影响早诊断及早治疗，且可能会出现污染。即使培养阳性仍需进行菌种鉴定。笔者曾对2010—2012年结核病防治机构初治抗酸涂片镜检阳性及分枝杆菌培养阳性2 014例进行分枝杆菌菌种鉴定进行分析[2]，结果发现384例(19.1%)为非结核分枝杆菌(NTM)。因而，临床上对肺结核的细菌学确诊的患者，需要分枝杆菌培养阳性后进行菌种鉴定证实为复合结核菌群才能确诊，通常需要45 d左右。

精准医学通过高通量的基因组、蛋白质组等组学技术和医学前沿信息技术，对大样本人群与特定疾病进行生物标志物的分析与鉴定、验证与应用，从而精确寻找到疾病的病因及治疗的靶点，并对同一种疾病不同状态和过程进行精确亚分类，实现对于疾病和特定患者进行个性化精准治疗[3]。结核病病原学分子生物学诊断技术通过检测临床标本，以结核分枝杆菌相关基因为诊断标志物，检测标本中是否含有结核分枝杆菌核酸或MTB耐药基因。这种检测诊断技术弥补了MTB生长缓慢对检测周期的影响，同时对实验室的生物安全要求低于多种传统的细菌学诊断方法。因此，2013年WHO修订了结核病的诊断标准，将分子生物学诊断阳性患者纳入病原学阳性的范畴[4]；我国也在《肺结核诊断(WS288-2017)》中进行了相应的修订[5]。2020年6月WHO在结核病的有关快速诊断指南中指出[6]：开展分子生物学诊断，其目是增加经细菌确认的结核病病例的百分比(基于扩大使用比涂片显微镜更敏感的推荐诊断)，减少结核病误诊。

2 分子生物学检测在肺结核精准诊断中的作用

目前，分子生物学已在我囯结核病专科医疗机构广泛应用。MTB分子生物学诊断主要靶标为MTB基因组中特有保守的管家基因，常用IS6110、16S核糖体RNA(16SrRNA)、gyrB、rpoB等靶标基因[7]。有学者研究提出[8]，县区级具备分子MTB生物学核酸检测能力，其病原学阳性率(40.5%)较不具备MTB分子生物学核酸检测能力高(37.4%)，且检测时间仅需2～3 h，在提高对患者确诊率的同时能够大大缩短诊断时间。

分子生物学检测MTB包括MTB-DNA和MTB-RNA检测两种。各种MTB分子生物学诊断技术比较见表1。表1中前5项均为检测MTB-DNA，而后1项是检测MTB-RNA。有学者对疑似肺结核347例患者及确诊肺结核172例患者同时采用MTB培养和GeneXpert MTB/RIF、实时荧光PCR等温扩增技术进行比较分析[9]。在疑似肺结核病患者和确诊肺结核病患者中，其MTB培养阳性率为21.6%和45.4%，而联合分子生物学检测后其阳性率达到28.5%～33.1%和57.6%～62.2%。然而，由于该研究的是MTB-DNA，不能鉴别是活菌或死菌，特别在复治肺结核患者诊断上，要注意排除肺结核是否复发。TB-RNA实时荧光核酸恒温扩增检测技术检测可快速检测标本中的MTB,并且可判断是否为活MTB。笔者前期研究报道[10]，将242例疑似肺结核患者(疑似肺结核组),与临床已排除肺结核肺部其他疾病患者96例(对照组)进行分析。发现疑似肺结核组242例中痰培养阳性233例,其中菌种鉴定MTB感染者222例,NTM感染者11例；痰培养结果阴性9例。对照组痰培养结果均为阴性。疑似肺结核组菌种鉴定为MTB感染222例TB-RNA检测阳性192例,与菌种鉴定符合率为86.5%(192/222)；NTM感染11例TB-RNA检测阳性0例(0/11),与菌种鉴定符合率为100.0% (11/11)；对照组TB-RNA检测阳性者2例(2.1%,2/96),与分枝杆菌培养符合率为97.9%(94/96)。TB-RNA检测在疑似肺结核患者诊断中的敏感度为86.5%(192/222),特异度为97.9% (94/96)。因TB-RNA是检疫结核分枝杆菌的RNA，因此，其阳性结果提示为活动性肺结核。

表1 各种结核分子生物学诊断技术比较(培养为金标准)

全基因组测序(WGS)方法是利用DNA测序平台重新构建生物体基因组的完整DNA序列。国内有学者对105例疑似结核病患者采用分枝杆菌培养、WGS和GeneXpert检测并与临床最终诊断相比[11]，WGS对所有活动性结核病病例的敏感性为44%，与GeneXpert(42%)相似。中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识明确[12]：对于结核分枝杆菌等胞内菌,二代测序的检测效能会相对降低,应对上述菌群设置特定的序列数阈值。

因而，在临床上对于疑似肺结核患者除应进行抗酸涂片镜检及分枝杆菌培养外，应采用MTB分子生物学检测。(1)若细菌学检查阳性和分子生物学检测阳性，即可诊断肺结核。(2)若细菌学检查阳性和分子生物学检测(TB-DNA)阴性，注意排除NTM感染，可再次收集标本重复检测，或用敏感度更高的分子生物学方法进行检测。(3)若细菌学检查阴性和分子生物学检测阳性，无结核病治疗史患者，可再次收集标本重复检测；如有肺结核治疗史患者应了解患者既往临床和影像学资料及与近期的临床和影像学资料关联性，进行综合诊断。(4)不推荐常规使用全基因组测序。

3 分子生物学检测在肺结核耐药性精准诊断中的作用

全球2019年登记报告耐多药/利福平耐药(MDR-TB/RR-TB)患者206 030例，占估算MDR-TB/RR-TB发病总数46.5万之44%[1]。因此，早期发现MDR/RR-TB、广泛耐多药结核病(XDR-TB)是结核病控制的重点。2020年10月27—29日，WHO组织了关于广泛耐药结核病定义的专家线上研讨会[13]，再次明确耐多药指异烟肼及利福平耐药，并修订了pre-XDR-TB以及XDR-TB定义。(1)pre-XDR-TB:由符合MDR/RR-TB定义、同时对任意氟喹诺酮类药物耐药的MTB菌株引起的结核病；(2)XDR-TB:由符合MDR/RR-TB定义、同时对任意氟喹诺酮类药物以及至少一种其他的A组药物(氟喹诺酮类药物、利奈唑胺及贝达喹啉)耐药的MTB菌株引起的结核病。因此，在结核病耐药性诊断方面，主要针对MDR/RR-TB及XDR-TB的耐药情况。

MTB耐药分子生物学检测主要是针对常用和已知的抗结核药物耐药靶基因突变，包括药物靶标基因和参与药物活化基因。然而，由于MTB耐药分子生物学检测无法确定标本中耐药细菌的比例，可能难以从患者体内同时分离出敏感菌株和耐药菌株[14]。因此，分子生物学检测不能完全取代传统表型药物敏感试验，可作为耐药MTB快速筛查方法和(或)传统药物敏感试验的补充。目前，我国医疗机构主要开展下列4种生物学检测[7]，其生物学检测结核分枝杆菌的耐药敏感度见表2。

表2 4种生物学检测结核分枝杆菌的耐药敏感度

分子生物学检测耐药可以实现耐药结核病的快速诊断，但检测的敏感性依赖于检测耐药突变位点的数量。然而，WGS可检测目前所有已知的耐药相关突变。有学者为探讨WGS检测一线和二线耐药抗结核药物诊断准确性，对2005—2015年10年间发表的20篇文献荟萃分析[15]。一线抗结核药物利福平耐药敏感度和特异度检测值分别为0.98(95%CI0.93～0.98)、0.98(95%CI0.98～1.00)、异烟肼耐药敏感度和特异度分别为0.97(95%CI0.94～0.99)和0.93(95%CI0.91～0.96)；其他一线药物其耐药敏感度和特异度检测值变异较大。氟喹诺酮类(FQs)药物敏感度和特异度分别为0.89(95%CI0.80～1.00)和1.00。作者提出，WGS可被认为是现有的利福平和异烟肼表型和分子药敏试验方法的一种有前途的替代方法。然而，WGS对核酸总量和质量要求很高，其测序失败率高于PCR和线性探针的传统分子检测手段；而且由于分析流程繁琐、数据量过大导致分析时间远长于预期(需要21 d)，与传统诊断方法20 d比较，WGS并没有缩短检出时间[16]。

因此，临床上对肺结核患者必需进行MTB分子生物学耐药性检测。(1)若细菌学药物敏感试验和MTB分子耐药性检测结果一致，相应结果可作为待测菌株对相应药物耐受性的判定依据{14}。(2)MTB分子生物学耐药性检测对RFP、INH和FQs耐药、细菌学药物敏感试验敏感；初治患者再次收集标本重复分子生物学耐药性检测，耐药者可诊断为耐药性肺结核病；敏感者可结合临床可诊断为非耐药性肺结核病。复治者结合既往临床和影像学资料及与近期的临床和影像学资料，可诊断为耐药性肺结核病。(3)MTB分子生物学耐药性检测对RFP、INH和FQs敏感、细菌学药物敏感试验耐药可判断为MTB的异质性耐药。(4)不推荐常规使用WGS。

综上所述，肺结核病作为一种传染性疾病，其诊断延误可导致结核病在社区中暴发。合理应用分子生物学检测MTB可达到早期诊断和精准诊断，是控制结核病的关键。在结核病和利福平耐药结核病患者中，应至少分别对异烟肼和氟喹诺酮类药物的额外耐药性开展及时检测，以指导治疗决策[17]。