循环游离DNA水平监测对乙型肝炎肝硬化失代偿期患者预后评估的临床价值

杨兆利 白红英 闫道杰

慢性乙型肝炎患者可因肝脏反复损伤、纤维化进而发展为乙型肝炎肝硬化，常伴随门静脉高压等多种并发症，甚至合并肝癌。循环游离DNA(circulating free DNA, cfDNA)是细胞凋亡和(或)组织损伤的标志物，通常由受损的组织细胞、炎症细胞等释放，其在血液循环中的表达水平可反映组织细胞的损伤程度。目前已发现,cfDNA与癌症、创伤、脓毒症、心肌梗死等多种疾病的发生有关。因此，有研究[1-2]认为cfDNA具有一定的预后预测能力，但其对乙型肝炎肝硬化失代偿期患者预后评估作用，尚少见文献报道。本研究拟观察血清乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)cfDNA水平变化在乙型肝炎肝硬化失代偿期患者预后评估中的临床价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2014年7月—2015年7月在济南市人民医院诊治的乙型肝炎肝硬化失代偿期患者112例，其中，男78例、女34例;年龄为(51.1±9.8)岁,病程5～20年。Child-Pugh A级39例，年龄为(51.3±8.7)岁；B级31例，年龄为(50.1±10.8)岁；C级42例，年龄为(52.4±7.4)岁。纳入标准:符合《病毒性肝炎防治方案》[3]中的失代偿期肝硬化诊断标准；初始应用阿德福韦酯+拉米夫定或替比夫定+阿德福韦酯抗病毒治疗；无自身免疫性肝炎；预计生存期>1年；无其他严重的器质性疾病。排除标准：①临床资料不全；②伴有严重心血管和呼吸系统疾病；③合并恶性肿瘤；④行脾切除术或经颈静脉肝内门腔分流术等手术；⑤合并原发性肾脏疾病；⑥因血液系统疾病和非肝病原因死亡；⑦因巴德-吉亚利综合征、门静脉畸形等引起的食管静脉曲张破裂出血者。选择同期年龄、性别相匹配的32例门诊健康体检者作为对照组，其中男21例、女11例，年龄为(51.4±10.9)岁。112例患者与32例健康体检者性别和年龄的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。本研究通过医院伦理委员会审核和批准(批准号为2014lw-2)，所有研究对象均已签署知情同意书。

1.2 分组比较cfDNA的差异 根据Child-Pugh分级标准将112例患者分为Child-Pugh A级组、Child-Pugh B级组和Child-Pugh C级组；根据是否出现上消化道出血分为出血组(48例)和未出血组(64例)；根据肝静脉压力梯度(hepatic venous pressure gradient,HVPG)分为高HVPG组(>20 mmHg，1 mmHg=0.133 kPa,50例)、中HVPG组(15～20 mmHg，29例)和低HVPG组(10～<15 mmHg，33例)。比较对照组与各病例组间血清cfDNA的差异。

1.3 血清cfDNA的定量检测 取5 μL血清样品，用双蒸水稀释至100 mL。用Tris-EDTA(TE)缓冲液(上海生工生物工程有限公司)稀释人基因组DNA标准溶液(北京孚博生物科技有限公司)至0、 50、 100、 200和400 μg/L质量浓度。将测试样品和标准品稀释并置于95 ℃的坩埚中加热5 min使DNA解链，随即将其快速置于冰上以维持单链状态。将含有50%裂解液、1 μg/L蛋白酶K(南京金斯瑞生物科技有限公司)的90 μL探针准备液和10 μL测试样品加入到96孔板中(均检测3个复孔)，用锡箔密封，置于55 ℃杂交箱中孵育过夜，用缓冲液洗涤96孔板3次，依次加入前扩增探针、扩增探针，以55 ℃保持1 h，共洗涤3次，然后加入标记探针，以50 ℃保持1 h，洗涤3次后，加入碱性磷酸酶底物催化剂(dioxetane,北京孚博生物科技有限公司)，用锡箔密封，在室温下静置5～10 min，显影发光，应用微孔板发光仪(美国Promega公司)检测每个孔光子数。以标准品的浓度为横坐标，检测到的光子数为纵坐标，绘制标准曲线，并获得浓度与光子数相关的方程式。然后，根据等式计算每孔的cfDNA水平，×20获得每孔稀释前的cfDNA水平。

1.4 预后影响因素的研究 对研究对象进行电话随访，直至患者发生终点事件或研究结束，终点事件定义为患者死亡。分析生存组与死亡组患者入院时的合并症、临床模型评分和实验室检查结果;本研究截止日期为2019年6月30日。

2 结 果

2.1 不同分组法各组患者血清cfDNA水平及其生存情况 与对照组相比，不同Child-Pugh分级组患者血清cfDNA均显著升高(P值均<0.05)，且B级组患者血清cfDNA显著高于A级组(P<0.05)，C级组显著高于B级组(P<0.05)。与对照组相比，出血组与未出血组患者血清cfDNA均显著升高(P<0.05)，且出血组患者血清cfDNA显著高于未出血组(P<0.05)。与对照组相比，不同HVPG组患者血清cfDNA均显著升高 (P值均<0.05)，且中HVPG组患者血清cfDNA显著高于低HVPG组(P<0.05)，高HVPG组患者血清cfDNA显著高于中HVPG组(P<0.05)。对各组患者48个月的生存情况进行统计后发现，Child-Pugh C级组患者病死率显著高于Child-Pugh B级组患者，Child-Pugh B级组患者病死率显著高于Child-Pugh A级组患者(P值均<0.05)；出血组患者病死率显著高于未出血组(P<0.05)；高HVPG组患者病死率显著高于中HVPG组患者，中HVPG组患者病死率显著高于低HVPG组患者(P值均<0.05)。见表1。

表1 不同分组法的乙型肝炎肝硬化患者与对照组血清cfDNA水平和48个月生存情况比较

2.2 临床资料分析结果 比较生存组与死亡组之间所有实验室检查结果、临床模型评分、合并症的差异，分析得出18项参数P<0.1，纳入下一步回归分析。见表2。

2.3 单因素Cox回归分析对预后有影响的因素 将生存组与死亡组比较后得出的18个预后因素逐一纳入Cox回归模型中进行单因素分析，对分类变量赋值，其原则：①自发性细菌性腹膜炎(SBP)、肝肾综合征，“无”=0，“有”=1；②肝性脑病，“无”=0，“1或2级”=1，“3或4级”=2；③腹水，“无”=0，“少量”=1，“中等或大量”=2；④其余分类变量，“阴性”=0，“阳性”=1。计量资料用实测值或将其进行对数变换后进行单因素Cox回归，共有14项因素与预后相关(P值均<0.05)。见表3。

2.4 多因素Cox回归分析结果 将单因素Cox回归分析得出的14项预后危险因素纳入多因素Cox回归模型进行筛选，结果显示腹水量、肝肾综合征、cfDNA水平、INR、Child-Pugh评分和终末期肝病模型(MELD)评分为预后不良的危险因素(P值均<0.05)。见表4。

表2 生存组与死亡组比较得出可能影响预后的参数

表3 乙型肝炎肝硬化失代偿期患者单因素Cox回归分析对预后有影响的因素

表4 乙型肝炎肝硬化失代偿患者多因素Cox回归分析结果

2.5 血清cfDNA水平评价乙型肝炎肝硬化失代偿预后的效能 以血清cfDNA实测值为检测变量，以分组为状态变量，定义状态变量值为1，绘制ROC曲线，见图1。ROC曲线显示: 3 406.34 μg/L为最佳截断值，此时的AUC最大(0.74)，其中，cfDNA>3 406.34 μg/L者64例，占57.1%；cfDNA≤3 406.34 μg/L者48例，占42.9%。提示当cfDNA≤3 406.34 μg/L时，患者预后好，生存率高；当cfDNA>3 406.34 μg/L时，患者预后差，病死率高。

2.6 血清cfDNA水平与患者预后的关系 以血清cfDNA 3 406.34 μg/L为截断值，将患者分为低水平cfDNA组与高水平cfDNA组，并绘制累积生存函数曲线，从图中得出低水平cfDNA组和高水平cfDNA组24个月的累积生存率分别为89.6%和78.1%，48个月累积生存率分别为68.8%和45.3%，差异均有统计学意义(P值均<0.001)。见图2。

图1 乙型肝炎肝硬化失代偿期患者血清cfDNA水平的ROC曲线

图2 高水平cfDNA组与低水平cfDNA组乙型肝炎肝硬化失代偿期患者生存情况比较

3 讨 论

cfDNA是释放到血清中的游离DNA片段，可在血液中自由循环,由小片段(70～200 bp)和较大片段(21 000 bp)组成[4-5]，在健康人和患者的血清中均可检测出。cfDNA在体液中处于一种动态平衡过程，已有研究发现随着年龄的增长，血清cfDNA水平显著升高。推测健康人体内cfDNA起源于淋巴细胞或其他有核细胞[6-7]，另外有部分cfDNA由受损的组织细胞、炎症细胞等释放，因此与很多疾病密切相关[8-9]。目前，cfDNA可作为一种有效的生物学标志物用于多种疾病的评估，包括但不限于癌症、胎儿医学、创伤、败血症、无菌性炎症和镰状细胞贫血等。

乙型肝炎肝硬化是临床上常见的慢性进行性肝病，如病情持续进展将进入失代偿期，对患者的健康造成极大威胁[10-11]。因此，临床上亟待寻找一种准确、客观、实用的检测指标，用于对患者疾病严重程度和预后的有效评估。目前已发现乙型肝炎携带者血清cfDNA水平显著高于健康人，同时也有研究指出血清cfDNA水平与乙型肝炎相关的原发性肝癌的预后呈负相关，表明cfDNA可能是预测HBV疾病预后的重要标志物[12]。乙型肝炎患者血清cfDNA水平升高的原因可能为乙型肝炎病毒的复制导致了肝细胞损伤，并产生大量炎症因子，此过程中细胞内DNA降解为小片段，并释放进入血液循环，导致血清cfDNA水平显著升高[13-14]。

早期研究只提出cfDNA水平在乙型肝炎患者中显著升高，并且其血清水平可能与由乙型肝炎肝硬化导致的肝癌具有相关性。本研究将乙型肝炎肝硬化失代偿期患者按照Child-Pugh分级、HVPG、是否合并上消化道出血进行分组，并探讨各分组血清cfDNA水平的差异，结果发现，各分组患者血清cfDNA水平均高于对照组，且患者血清cfDNA水平随着Child-Pugh分级和HVPG升高，以及并发上消化道出血现象而升高。这一结果提示血清cfDNA水平与患者病情相关。

Cox比例风险回归模型主要用于生存资料的影响因素分析与多变量生存预测，且可以排除变量之间的相互干扰。本研究采用Cox回归模型进行单因素和多因素回归分析，最终筛选出7个对预后有影响的独立危险因素，其中血清cfDNA水平也可用于对乙型肝炎肝硬化的预后评估。采用ROC曲线确定血清cfDNA水平的截断值，并根据截断值将所有研究对象分为高cfDNA和低cfDNA两组。统计显示，高cfDNA组患者预后显著差于低cfDNA组。本研究提示，血清cfDNA检测可成为临床医师评估乙型肝炎肝硬化失代偿期患者预后的一种标志物，具有进一步研究的价值。