重庆市HIV与NTM双重感染患者的菌种分布及耐药情况

刘敏 李明俊 余庆 何坤 吴玉珊 杨红红 李同心

非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)是指除结核分枝杆菌复合群和麻风分枝杆菌以外的一大类分枝杆菌的总称。迄今为止，共发现NTM菌种190余种，14个亚种，其中大部分为寄生菌，仅少部分对人体致病，为条件致病菌[1-3]。近年来，NTM感染率呈快速上升趋势，可引起肺部、皮肤、软组织、骨关节、淋巴结等部位感染，尤其是对于免疫功能低下的人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染者，并发NTM感染率较高，且易被误诊为MTB感染。有研究显示，在广西、上海等地区HIV感染者的分枝杆菌培养阳性标本中约50%为NTM感染[4-6]。但不同地区由于自然环境及人群生活习惯等差异，导致HIV并发NTM感染的发生率不同，且NTM菌种分布及耐药情况亦有所差异。为进一步了解重庆市HIV与NTM双重感染患者的临床特征及NTM的耐药情况，本研究收集重庆市HIV与NTM双重感染患者的临床资料，分析NTM菌种构成及耐药情况，以指导临床合理诊疗。

对象和方法

一、研究对象

收集2019年6月至2020年6月在重庆市公共卫生医疗救治中心感染科明确诊断为HIV与NTM双重感染的44例患者，占同期收治HIV并发所有分枝杆菌感染患者的23.8%(44/185)。HIV感染的诊断参考2018年中华医学会感染病学分会艾滋病学组制定的《中国艾滋病诊疗指南(2018版)》[7]。NTM感染的诊断参考2019年《人类免疫缺陷病毒/艾滋病患者合并非结核分枝杆菌感染诊治专家共识》[8]。

二、研究方法

回顾性收集所有研究对象的临床资料(基本信息、临床症状、检测指标等)。计算NTM菌种的耐药发生情况。分枝杆菌菌种鉴定检测试剂盒由亚能生物技术(深圳)有限公司生产，可以鉴定22种分枝杆菌，分别为耻垢分枝杆菌、结核分枝杆菌复合群、次要分枝杆菌、胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胃分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、瘰疠分枝杆菌、母牛分枝杆菌、龟分枝杆菌龟亚种、龟分枝杆菌脓肿亚种、苏尔加分枝杆菌、海/溃疡分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、迪氏分枝杆菌、偶发/猪分枝杆菌、浅黄分枝杆菌、猿猴分枝杆菌、土分枝杆菌、草分枝杆菌、不产色分枝杆菌、戈登分枝杆菌。

NTM药物敏感性(简称“药敏”)试验(微孔板)使用的试剂盒由珠海银科医学工程有限公司生产。操作方法：(1)取出冻干杂菌抑制剂和稀释液，将稀释液加入冻干粉，充分混匀。(2)取出液体药敏培养基和药敏测试板，恢复至室温。吸取200 μl杂菌抑制剂加入液体药敏培养基，充分混匀。(3)用一次性接种环挑取待测菌株新鲜菌落，移至专用比浊管，将比浊管放入自动超声分散仪进行磨菌比浊至1 mg/ml，静置5～10 min后取200 μl 1 mg/ml的均匀细菌上清至已加入杂菌抑制剂的液体药敏培养基，充分混匀。(4)打开YK96自动移液平台，将已加细菌的培养基、空白培养基和药敏测试板放入平台指定空位，运行“96孔”加样模式。(5)待加样完毕，盖上微孔板盖子，用胶条封闭板条空隙，置37 ℃生化孵育箱培养。(6)结果判断：第3～7天观察结果，孔底出现白色菌体沉淀的为阳性，无菌体沉淀的为阴性。阴性孔于第10天再观察一次结果。最低抑菌浓度(MIC)为无白色沉淀的96微孔对应的最小药物浓度。当难以判定MIC孔时，可将该孔与“1/10参照孔”作比较，如果该孔沉淀菌体小于“1/10参照孔”沉淀，即可判定生长被抑制。

三、统计学处理

结 果

一、一般情况及临床特征

44例HIV与NTM双重感染患者年龄范围24～69岁，平均年龄(47.1±12.8)岁；其中19例(43.2%)有吸烟史，7例(15.9%)既往有肺结核病史。患者入院时主要临床表现有咳嗽、咳痰、发热、气促症状，发热以中低热为主，见表1。分离出NTM的标本来源分别为：痰液38份(86.4%)、血液4份(9.1%)、脑脊液1份(2.3%)、浅表包块分泌物1份(2.3%)、尿液1份(2.3%)，其中1例患者痰液及血液中均发现NTM。实验室检查发现44例患者中34例(77.3%)存在不同程度贫血，血红蛋白中位数为101.0 g/L(正常值范围：130～175 g/L)，白细胞及血小板均值均处于正常范围(白细胞计数正常范围：3.5×109/L～9.5×109/L，血小板计数正常范围：125×109/L～350×109/L)，29例(65.9%)C反应蛋白(CRP)升高，中位数为32.3 mg/L(正常值范围：0～10 mg/L)，CD4+T淋巴细胞计数44个/μl(正常值范围：414～1123个/μl)，其中低于200个/μl 者40例(90.9%)。44例患者中9例(20.5%)初始治疗方案给予抗NTM方案治疗(方案中包含乙胺丁醇、利福布汀、左氧氟沙星、阿米卡星、阿奇霉素)，24例(54.5%)初始给予常规抗结核方案治疗(异烟肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、左氧氟沙星)，11例(25.0%)由于临床症状轻，住院时间较短，出院时抗酸杆菌培养结果尚未报告，故住院期间未启动抗分枝杆菌治疗。后续随访过程中结合持续存在的临床症状、实验室检查及影像学等指标综合评估后，全部给予抗NTM治疗。

表1 44例HIV与NTM双重感染患者一般资料

二、NTM菌种鉴定结果

44株NTM菌株经PCR-反向点杂交法鉴定，共明确鉴定出8种NTM菌种，有2例菌株抗酸染色为阳性，超出本研究采用的菌种鉴定试剂盒鉴定范围，未能明确鉴定出菌种。结果显示，HIV感染者中鸟分枝杆菌占比最多(34.1%)，其次为胞内分枝杆菌(20.4%)，偶发/猪分枝杆菌及堪萨斯分枝杆菌各有5株(11.4%)，见表2。

表2 44株NTM菌种分布情况

三、NTM药敏试验结果

44株NTM菌株均完成表3中第1～8种药物的药敏试验，其中21例患者同时完成第9～15种药物的药敏试验，28例患者同时完成第16～22种药物的药敏试验。结果显示，44例患者NTM耐药率高，对常用的抗结核药物异烟肼、对氨基水杨酸异烟肼、利福平的耐药率分别高达81.8%、75.0%、45.5%，对阿奇霉素耐药率亦高达61.9%。耐药率较低的药物有利福布汀和克拉霉素，分别为6.8%和11.4%，氯法齐明、阿米卡星耐药率也相对较低，但均接近30%。菌种分布中占比最高的鸟分枝杆菌耐药形势较为严峻，见表3。

表3 不同药品在不同NTM菌株中的耐药情况

讨 论

HIV感染者免疫力低下，相较于非HIV感染人群，更容易感染NTM；在部分发达国家甚至超过了MTB感染率[9]。本研究中心为重庆市唯一一家集中收治艾滋病患者的三级传染病专科医院，研究结果具有一定的代表性。结果显示，重庆市HIV感染者中分枝杆菌培养阳性标本NTM占23.8%，需临床医师高度警惕。本研究结果还显示，HIV与NTM双重感染患者临床表现与MTB相似，缺乏特异性，且超过15%的患者既往有MTB感染史，临床易被误诊为MTB，仅20.5%的患者初始治疗方案给予抗NTM治疗。故在选择治疗方案前需尽可能寻找病原学依据明确诊断，或者在抗结核试验性治疗过程中发现治疗效果不佳时，亦需警惕是否为NTM感染。NTM可侵犯人体多部位多系统，本研究中15.9%的培养阳性结果来源于非痰液标本。故针对不同患者，应留取多部位标本，同时运用多种检查方法(抗酸杆菌涂片、PCR、分枝杆菌培养)查找病原菌，而非局限于痰液标本，以提高培养阳性率。若同一例患者抗酸杆菌涂片阳性，而结核DNA或RNA检测显示阴性时，亦需警惕是否为NTM感染。

鸟分枝杆菌是HIV与NTM双重感染患者NTM感染菌株中最常见的菌种[10]。上海、广西等地HIV与NTM双重感染患者中鸟分枝杆菌占比为43.3%～54.0%[4-5]。本研究结果显示，重庆市NTM感染患者中鸟分枝杆菌亦为最常见菌种(34.1%)，占比低于上海、广西等地[4-6]，高于非洲西部地区(23.7%)[11]，考虑与气候环境等因素相关。张汇征等[12]2019年进行的研究显示，重庆市非HIV感染人群并发NTM感染菌株中以脓肿分枝杆菌为主(39.5%)，其次为胞内分枝杆菌(34.9%)，而鸟分枝杆菌仅占7.0%。可见，不同特征人群NTM检出率存在差异，且检出的NTM菌种构成比亦有明显差异，考虑系人群免疫功能差异所致。

NTM耐药率极高，大多数NTM感染者对抗结核药物具有天然耐药性[13]。贾彤等[14]研究显示，较常见的NTM对常用的一线抗结核药物如异烟肼、利福平普遍耐药，耐药率近100%。秦中华等[15]的研究显示，NTM对二线抗结核药物如卡那霉素、氧氟沙星的耐药率亦分别高达80.6%和68.1%。有研究显示，HIV与NTM双重感染患者病死率高达29%[16-17]。本研究显示，重庆市HIV与NTM双重感染患者对异烟肼、对氨基水杨酸异烟肼、阿奇霉素、利福平的总体耐药率分别高达81.8%、75.0%、61.9%、45.5%，可供选择药物种类有限。耐药率相对较低的药物有利福布汀、克拉霉素，其次为丙硫异烟胺、氯法齐明、阿米卡星。需特别指出的是，本结果显示HIV并发鸟分枝杆菌感染者对丙硫异烟胺的耐药率高达100%，该结果有别于广东地区HIV并发鸟分枝杆菌感染对丙硫异烟胺的耐药率(7.1%)[14]，亦有别于重庆市非HIV感染者出现鸟分枝杆菌感染时对丙硫异烟胺的耐药率(33.2%)[13]。因此，对于HIV与NTM双重感染患者，有必要行NTM菌种鉴定及耐药检测，以便指导下一步治疗，不能简单套用不同省市、不同特征人群NTM药敏试验结果选择治疗方案。针对无法行菌种鉴定及耐药检测的医疗机构，可参考当地相同特征人群的NTM耐药报告给予经验性治疗，治疗过程中注意抗NTM药物与抗HIV药物间的相互作用。

总之，由于HIV感染者免疫功能低下，易并发NTM感染，以鸟分枝杆菌及胞内分枝杆菌为主。该群体NTM耐药形势严峻，在诊疗过程中需高度警惕，对HIV感染者进行准确的分枝杆菌菌种鉴定及药敏试验对临床诊治具有重要意义。本研究分析亦存在不足，如44例NTM感染患者并非全部完成22种药物的药敏试验，且总体样本量偏少，有待收集更大样本更深入地明确重庆市HIV与NTM双重感染的现状及疗效。