不同他克莫司血药浓度检测方法的对比分析

郭奉洁，马锡慧，李彬钰，孙玉洁（.解放军总医院第八医学中心卫勤部，北京0009；.解放军总医院第八医学中心原移植研究室，北京 0009）

他克莫司（Tacrolimus，Tac）是从筑波链霉菌的培养液中分离获得的一种大环内酯类抗菌药物，因其高效的免疫抑制作用已被广泛应用于各种实质器官的临床移植［1］。由于Tac 吸收存在明显的个体间和个体内差异，治疗指数较低，安全范围相对较窄，浓度过高易致毒性，过低又易发生排斥反应。因此，对Tac 进行严密的血药浓度监测使其处于安全有效的治疗范围尤为重要。目前，临床上Tac 血药浓度的检测方法主要包括酶联免疫吸附法、酶增强免疫法、微粒子酶免疫法、化学发光微粒子免疫法以及高效液相色谱-质谱联用法等，各种检测方法都有其自身的特点［2］。胶乳增强免疫抑制法检测Tac 血药浓度未见文献报道，本文通过分析化学发光微粒子免疫法和胶乳增强免疫抑制法检测Tac 全血药物浓度的结果，评价两种方法测定Tac 血药浓度的一致性。

1 资料与方法

1.1 研究对象：选取在解放军总医院第八医学中心进行Tac 血药浓度检测的肾移植受者96 例作为研究对象，其中男性66 例，女性30 例，年龄15 ～79 岁，平均年龄（44±12）岁，所有患者均采用Tac + 吗替麦考酚酯+肾上腺皮质激素（激素）三联抗排斥治疗方案，Tac 服用剂量随术后时间、血药浓度结果和患者临床情况进行适当调整。

1.2 实验仪器与耗材：雅培ARCHITECT i1000SR全自动免疫分析仪，FUNOTEC FC300 全自动生化分析仪，试剂为各自配套的Tac 测定试剂盒，质控品为伯乐公司的全血免疫抑制剂质控物，采用高、中、低三个浓度。贝克曼高速离心机（AllegraTM21R Centrifuge），涡旋振荡器（Thermo Scientific），移液器（200 μl、1 ml）及配套枪头。

1.3 实验方法

1.3.1 样本采集：所有患者口服药物前采集上肢静脉血2 ml 于EDTA-K2 抗凝管中（4℃冰箱保存备用），测定Tac 药物谷浓度，所有样本在采集1 d内完成检测。

1.3.2 定标与质控：化学发光微粒子免疫法根据0.0、3.0、6.0、12.0、20.0、30. 0 μg/L 6 个浓度的FK506 标准液绘制标准曲线，随行低（4.84 μg/L）、中（9.42 μg/L）、高（15.1 μg/L）三个浓度的Tac质控品进行室内质控。胶乳增强免疫抑制法根据0.0、3.0、6.0、10.0、20.0、30. 0 μg/L 6 个浓度的Tac 标准液绘制标准曲线，随行低（4.54 μg/L）、中（12.6 μg/L） 、高（24.2 μg/L）3 个浓度的Tac 质控品进行室内质控。1.3.3 操作方法：在室内质控在控的条件下，用两种方法平行检测Tac 血药浓度，操作时，严格按照两种方法各自配套Tac 测定试剂盒说明书对质控品和临床样本进行样本前处理和检测。

1.3.4 统计学方法：采用SPSS 23.0 软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以（±s）表示，两组数据的差异性分析采用配对t 检验，相关性分析采用Pearson 相关分析，回归分析采用一元线性回归，图形绘制采用GraphPad Prism 5 软件。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两种方法检测Tac 血药浓度结果差异性分析：化学发光微粒子免疫法测得的Tac 血药浓度为（5.78±2.18）μg/L，胶乳增强免疫抑制法测得的Tac 血药浓度为（6.51±2.32）μg/L，经配对t 检验，t ＝12.237，P ＝0.000（P ＜0.001），即两种方法检测Tac 血药浓度结果具有显著性差异，化学发光微粒子免疫法普遍低于胶乳增强免疫抑制法，两种方法检测Tac 血药浓度差异性分析结果结果见表1，两种方法检测Tac 血药浓度结果分布见图1。

表1 两种方法检测Tac 血药浓度差异性分析结果

图1 两种方法检测Tac 血药浓度分布图

2.2 两种方法检测Tac 血药浓度结果相关性分析：Pearson 相关性分析结果显示，两种方法检测Tac血药浓度结果呈正相关（r ＝0.9676，P ＜0.0001）。对于每份样本，以化学发光微粒子免疫法检测结果为横坐标，以胶乳增强免疫抑制法检测结果为纵坐标，绘制散点图，见图2。

2.3 两种方法检测Tac 血药浓度结果回归分析：对两种方法检测Tac 血药浓度结果进行一元线性回归分析，建立回归模型，经检验F ＝1378.911，P ＝0.000（P ＜0.05），即建立的回归模型有意义。进而得到一元线性回归方程Y ＝0.551+1.032X（其中X 为化学放光微粒子免疫法，Y 为胶乳增强免疫抑制法）。

图2 两种方法检测Tac 血药浓度结果相关性分析图

3 讨 论

随着器官移植技术的不断发展，Tac 在临床上的应用也越来越广泛。因其个体吸收差异大和药理药代特点， 使得Tac 药物浓度监测意义重大［3］。而选择灵敏可靠的检测方法对于临床制定个体化用药方案尤为重要。目前，临床上Tac 血药浓度的检测方法主要有酶联免疫吸附法、酶增强免疫法、微粒子酶免疫法、化学发光微粒子免疫法以及高效液相色谱-质谱联用法等，各种方法都有其自身的特点，随着免疫学检测技术的不断发展和检测仪器的推陈出新，Tac 检测方法也不断横向扩展，有关方法学及两种方法对比的文献已见报道［4-6］，但胶乳增强免疫抑制法检测Tac 血药浓度的方法未见报道，本文通过分析两种方法测得Tac 血药浓度结果，评价两种方法的差异性和相关性，以期为临床制定个体化用药方案提供理论依据。

化学发光微粒子免疫法是近年来发展起来的一种高灵敏度的方法，其在检测Tac 浓度之前，需对样本进行预处理，将全血中与蛋白结合的Tac 萃取出来。检测原理为采用吖啶酯标记的Tac 分子作为竞争物，用Tac 单克隆抗体包被的顺磁微粒子作为捕获物，将样品与顺磁微粒子混合反应，加入竞争物，与微粒子上的抗体空位结合，外加磁场使微珠分离，清洗后加入预激发液与激发液产生化学发光反应，化学发光的强度与样品中Tac 的浓度成反比，根据标准曲线，求得样品中Tac 的浓度［7］。

胶乳增强免疫抑制法在测定Tac 浓度之前，同样需对样本进行预处理。检测过程中，样本中的Tac 与Tac 蛋白复合物中的Tac 竞争结合致敏胶乳颗粒表面的抗Tac 抗体，样本中的Tac 浓度越高，胶乳表面抗体被其结合的程度越大，Tac-蛋白复合物可引发的胶乳聚集程度越低，反应体系的浊度大小与样本中的Tac 浓度呈负相关，通过测定546 nm处的吸光度，建立校准曲线，计算全血样本Tac 的浓度。

两种方法检测Tac 血药浓度结果差异性分析显示：化学发光微粒子免疫法普遍低于胶乳增强免疫抑制法，且差异显著（P ＜0.001）。董新华等［8］用酶联免疫吸附法和微粒子酶免疫法同时检测200 份肾移植术后患者标本，结果显示两种方法测得结果差异显著。叶伟民等［9］用上述两种方法同时检测58 例肝移植和肾移植患者的标本，得出相同结论。张丽萍等［10］的研究结果显示，酶增强免疫分析法和微粒子酶免疫法测得的结果在低浓度时（＜8.0 ng/L）差异显著，在高浓度时（≥8 ng/L）差异无统计学意义。以上研究表明，不同方法检测Tac 血药浓度结果差异显著，不应相互比较。

两种方法检测Tac 血药浓度结果相关性和回归分析显示：两种方法相关性良好（r ＝0.9676，P ＜0.0001），这与其他检测Tac 血药浓度方法比较类文献的报道均一致［8-10］。说明几种方法都可以作为Tac 血药浓度的检测方法，不同实验室可根据实际情况进行选择。本文通过一元线性回归分析，建立回归模型（F ＝1378.911，P ＝0.000），进而得出线性回归方程Y ＝0.551+1.032X（其中X 为化学放光微粒子免疫法，Y 为胶乳增强免疫抑制法）。这与董新华等［8］的报道相似。

两种方法均在室内质控在控的条件下对样本进行了平行检测，为了客观评价两种方法的可靠性以及准确性，本研究认真按照标准规程操作，样本的采集、环境温度的控制、标本存放等各个环节均保持一致，避免了人为原因造成的检测误差。有文献报道［11］，化学发光微粒子免疫法与微粒子酶联免疫法检测Tac 浓度结果的差异无统计学意义，这可能与检测原理、仪器状态或检测环境有关。不同的方法对样本提取的过程不同，对代谢物的识别也不同，因此所得的结果也可能不同［12］。因样本收集限制，本研究中未包含高浓度（≥20 ng/L）样本，对于高浓度样本两种方法检测结果差异是否显著，需进一步研究。

综上所述，胶乳增强免疫抑制法和化学发光微粒子免疫法均可用于Tac 血药浓度监测，二者相关性良好，但二者测定Tac 血药浓度结果差异显著，检测结果不能相互比较，应建立各自的治疗窗范围进行判断，建议肾移植受者在进行Tac 血药浓度动态监测时，尽量选择同一检测方法和系统，以保证检测结果的纵向可比性，从而为临床制定个体化用药方案提供可靠依据。