杉木根际溶磷菌的筛选鉴定及溶磷能力分析

初 旭胡 霞刘 静李亚超罗明燕李 明,

（1.福建农林大学林学院，福建 福州 350002；2.福建农林大学人工林可持续经营福建省高校工程研究中心，福建 福州 350002）

磷是植物生长发育不可缺少的营养元素[1]，是植物进行光合作用、呼吸作用等物质和能量代谢等重要生命活动必不可少的营养元素。南方林地土壤对磷具有强烈的吸附固定作用，土壤磷大多以林木无法直接吸收利用的难溶性Fe−P、Al−P和闭蓄态磷的形式存在，导致土壤中全磷含量丰富而有效态磷素匮乏[2]，林木呈现“遗传学缺磷”现象。同时，生产上磷肥的大量施用不仅造成成本增加和环境污染，施入土壤中的磷肥也很容易重新被固定为难溶性磷，导致磷肥的当季利用率极低。杉木（Cunninghamia lanceolata）是我国特有的速生用材树种，具有生长快、材性优、用途广的特点，在我国南部18个省区广泛栽培，其人工林面积和蓄积量均居我国人工林树种的首位[3]。然而，长期的集约化纯林经营导致杉木人工林地土壤中氮、磷等必需营养元素的大量消耗，生产上多代连栽的经营模式加剧了杉木人工林地力衰退，导致土壤有效磷缺乏成为杉木人工林产量和质量提升的重要限制因子[4-5]。

溶磷细菌是一类具有降解难溶性无机磷和有机磷的微生物[6]。溶磷菌在土壤中的分布具有明显的植物根际效应，主要表现在根际土壤中的数量明显高于非根际土壤数量，溶磷菌能够定殖在植物根际周围，并将土壤中难以被植物直接吸收利用的磷转化为有效态的可溶性正磷酸盐[7]。大量研究表明：植物根际溶磷菌可以通过分泌和产生有机酸、分泌质子、分泌胞外多糖，以及细胞壁的吸附作用等形式将土壤中的难溶性磷转化为有效态磷，从而提高植物的磷素营养并促进植物生长[8]。当前国内外对于溶磷菌的研究包括利用溶磷菌对污染土地进行生态修复，高琼等利用溶磷菌可对多种重金属污染的农田进行修复[9-12]；以及对具有不同特性溶磷菌的筛选，Sarikhani等从55 ℃处理16 h的土样中筛选具有耐高温特性的溶磷菌，对克服微生物肥料生产和储存具有重要作用[13]；此外还有对其他林木根际土壤的溶磷菌的筛选工作，王俊娟等从油松（Pinus tabuliformis）根际土壤中筛选出一株泛菌属的溶磷细菌，对于增强土壤肥力，促进林木生长具有明显作用[14]。宋贤冲等[15]从广西马尾松（Pinus massoniana）根际土壤中筛选出一株伯克氏菌，对磷酸三钙具有较好的降解效果，而在杉木根际土壤的溶磷菌筛选报道甚少。李蓉等[16]对于杉木根际土壤的溶磷菌及其特性进行了初步研究，但并未对菌种进行分子鉴定以及测定菌种对其他难溶性磷的降解能力。本研究不仅筛选出了杉木根际土壤中的多种溶磷细菌，并测定了对3种不同难溶性磷的降解能力，同时揭示了杉木根际溶磷菌的最适溶磷条件，此外还发现了新型溶磷菌株−云南微球菌和孢子型乳酸菌。因此，筛选和鉴定能够定殖在林木根际的溶磷细菌，并通过生物工程的方法制备微生物菌肥，是改善林木根际磷素营养环境，促进人工林可持续经营的一种有效途径。

本研究从杉木根际分离和筛选溶磷细菌，并进行细菌的形态和分子鉴定。研究各溶磷菌株的溶磷能力，从而获得具有优良溶磷能力的杉木根际细菌，为开发和利用适合杉木的溶磷微生物菌肥提供基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集

采样地位于福建省福州市南屿国有林场，于2018年9月使用土钻分别采集南坡和北坡10年生和20年生杉木人工林的根系，共采集20个样点。将杉木细根抖落土壤后放入含纯水的离心管中洗脱，存于冰盒运回实验室，并于4 ℃冰箱保存。

1.2 试验方法

1）培养基配置。利用含难溶性磷酸三钙的固体PKO培养基筛选杉木根际溶磷细菌，内含有10 g/L葡萄糖，10 g/L Ca3(PO4)2，0.3 g/L MgSO4·7H2O，

0.3 g/L NaCl，0.3 g/L KCl，0.03 g/L FeSO4·7H2O，0.03 g/L MnSO4·4H2O，0.5 g/L(NH4)2SO4和15 g/L琼脂粉，pH值为7.0～7.2。使用液体LB培养基保存菌株，内含有5 g/L酵母提取物，10 g/L胰蛋白胨，10 g/L NaCl，pH值为7.0～7.2[17]。

2）溶磷细菌的分离。使用摇床将杉木根际土壤洗脱液置于PKO液体培养基中，在30 ℃、180 r/min避光条件下进行富集，3 d后取上清液作为溶磷细菌的原始菌液，利用10倍梯度稀释法配置成土壤悬液，加入纯水依照蔡璐等的稀释方法进行改进，稀释至10−9[18]，并分别取各个稀释梯度菌液100 μL悬液涂布到PKO筛选培养基平板上。在30 ℃条件下避光培养5～10 d，观察具有溶磷圈的菌落，待无新菌落产生后将溶磷菌落挑出培养在LB固体培养基上，并分离提纯单菌落，以上步骤均设置3组重复[19-20]。

3）各菌株溶磷活性分析。将溶磷菌单菌落接种在PKO培养基上，30 ℃避光条件下培养7 d，观察并测量各菌落产生的溶磷圈大小和菌落大小，计算各株菌落的圈径比，设置3次重复，根据溶磷圈大小分析各菌株的溶磷能力。

4）细菌形态和分子鉴定。在光学显微镜下观察获得的溶磷菌菌落形态特征，通过革兰氏染色观察细菌菌体特征，利用鞭毛染色观察细菌鞭毛着生位置和数目，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》[21]对细菌进行形态鉴定。采用Omega细菌DNA提取试剂盒提取细菌DNA，并使用通用引物fD1（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和rP1（ACGGTTACCTTGTTACGACTT）PCR扩增各菌株的16S rDNA序列。PCR产物在福州铂尚测序公司测序，获得的碱基序列在NCBI数据库Blast，筛选同源性高的序列使用软件Clustalx 1.83进行比对，并利用MEGA 5.0软件构建系统发育树，鉴定目的菌株类别[22]。

5）溶磷能力测定。将溶磷菌单菌落接入液体LB培养基进行3 d的活化，在50 mL离心管中分别加入25 mL LB液体培养基并接种1 mL活化的不同菌种菌液，设置3组平行试验，分别每组加入5 g/L的3种不同难溶性磷酸盐（磷酸铝，磷酸铁和磷酸钙），并设置不接种菌液为对照，在30 ℃，140 r/min摇床内避光振荡培养。培养7 d后，将离心管在4 ℃和4 000 r/min下离心10 min，取上清液，使用钼锑钪比色法测定可溶性磷含量[23-24]。

6）温度和pH值对菌株溶磷能力的影响。为分析环境温度和pH值对获得的溶磷菌株溶磷能力的影响，本试验选取对磷酸铝，磷酸铁和磷酸钙分别具有最强降解能力的3株菌株，测定其在20、25、30、40 ℃的菌液温度和5～10的菌液pH下溶磷能力的变化，使用钼锑钪比色法测定菌液可溶性磷含量。

1.3 数据分析方法

试验数据采用SPSS 22.0进行分析，差异显著性分析采用F检验。

2 结果与分析

2.1 溶磷细菌菌株分离与鉴定

定期观察涂布的PKO培养基平板，结果表明10−3、10−4梯度浓度下溶磷菌较多。试验共初筛到10株具有溶磷能力的菌株，各菌株在接种1～2 d开始出现溶磷圈（图1为CX−2、CX−7的溶磷圈），随后溶磷圈迅速扩大，在6～7 d速度明显下降，个别菌株溶磷圈停止增长。菌株溶磷活性分析显示，10株菌株溶磷圈的直径大小在多处于1.2～1.9 cm之间，溶磷圈直径与菌落直径之比在1.5～2.5之间，其中CX−2菌株具有最大圈径比，培养7 d时的圈径比为3.83（图2）。

图 1 土壤溶磷细菌溶磷圈Fig.1 Soil phosphorus dissolving bacteria phosphorus dissolving circle

对筛选获得的10株溶磷菌进行形态鉴定和分子鉴定，结合显示其分别隶属于放线菌门、变形菌门和厚壁菌门细菌的5个菌属、9个菌种（表1、图3）。菌株CX−2隶属于伯克氏菌科（Burkholderiaceae），副伯克氏菌属（Paraburkholderia），抗金属副伯克氏菌（Paraburkholder-ia metalliresistens）。菌株CX−9、CX−1和CX−6为孢子型乳酸菌（Sporolactobacillus laevolacticus）、热带伯克霍尔德菌（Burkholderia tropic）和海水芽孢杆菌（Bacillus aquimaris）。菌株CX−7隶属于芽孢杆菌科（Bacillaceae），芽孢杆菌属（Bacillus），苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringi-ensis）。菌 株CX−3和CX−4为 洋 葱 伯 克 氏 菌（Burkholderia cepacia）。菌株CX−5隶属于微球菌科（Micrococcaceae），微球菌属（Micrococcus），云南微球菌（Micrococcus yunnanensis）。菌株CX−8 为卢里达假单胞菌（Pseudomonas lurida），菌株CX−10为成团泛菌（Pantoea vagans）。

2.2 溶磷细菌菌株溶磷能力测定

对筛选所得的10株溶磷菌进行溶磷能力测定（磷标准曲线：c=1.869 9×A+0.003 2，R2=0.999 0，A为660 nm处样品吸光度）。结果表明CX−7菌株对磷酸铝具有较强的溶磷能力，较其他菌株差异显著，溶磷量为157.5 mg/L，相对于对照组增加了12.12%；这一难溶性磷源，CX−5菌株对磷酸铁具有较强的溶磷能力，较其他菌株差异显著，但对于CX−2差异不显著，溶磷量为135 mg/L，相对于对照组增加了10.38 %；CX−2菌株对磷酸钙具有较强的溶磷能力，较其他菌株差异显著，溶磷量为144 mg/L，相对于对照组增加了11.08 %（表2～4）。综合表明CX−2菌株对难溶性铁磷、钙磷都具有较好的溶磷效果，而对于难溶性磷铝磷，CX−7菌株则具有最好的溶磷效果。

图 2 土壤溶磷细菌降解磷酸三钙产生的溶磷圈与菌落的直径比率Fig.2 Ratio of diameter of dissolved phosphorus ring to colony produced by soil phosphate solubilizing bacteria

表 1 土壤溶磷细菌的形态鉴定Table 1 Morphological identification of soil phosphorus-dissolving bacteria

2.3 温度和pH值对菌株溶磷能力的影响

本试验测定了不同的温度及pH培养条件下，CX−2、CX−5和CX−7分别对磷酸钙、磷酸铝和磷酸铁的溶磷量变化曲线。结果显示，pH值为6时各菌株的溶磷量对pH值为5时差异不显著，对其余pH值呈显著差异。CX−7对磷酸铝的溶解能力在pH值为5时最高，CX−5对磷酸铁的溶解能力在pH值为6时最高，CX−2对磷酸钙的溶解能力在pH值为5和6时较高且差异不大（图4）。随着pH值的不断变化，3株溶磷菌的溶磷能力均呈先上升后下降的趋势，各菌株的最适溶磷pH值为5～6。温度变化结果显示，温度为20～30 ℃时，各菌株溶磷能力差异不显著。CX−7对磷酸铝的溶解能力在20～30 ℃时较为稳定；CX−5在25 ℃时对磷酸铁的溶解能力略有下降，在30 ℃溶磷能力达到最高；CX−2对磷酸钙的溶解能力在25 ℃上升到最高，而后随着温度升高逐渐降低（图5）。温度超过30 ℃后，3株菌株的溶磷能力均呈现显著下降的趋势，且差异显著，因此各菌株的最适溶磷温度为20～30 ℃。

图 3 土壤溶磷细菌16SrRNA系统发育树Fig.3 Soil phosphorus-dissolving bacteria 16SrRNA phylogenetic tree

表 2 10种菌株对于磷酸铝的溶解能力测定Table 2 Determination of the solvency of 10 strains for aluminum phosphate

表 3 10种菌株对于磷酸铁的溶解能力测定Table 3 Determination of the solvency of 10 strains for iron phosphate

表 4 10种菌株对于磷酸钙的溶解能力测定Table 4 Determination of the solvency of 10 strains for tricalcium phosphate

图 4 pH值变化对3株溶磷菌溶磷能力的影响Fig.4 Effect of pH change on phosphorus solubilization ability of 3 phosphorus solubilizing bacteria

图 5 温度变化对3株溶磷菌溶磷能力的影响Fig.5 Effect of temperature change on the ability of 3 strains of phosphate solubilizing bacteria to dissolve phosphorus

3 结论与讨论

长期以来，南方红壤区土壤固定态磷含量丰富而有效磷长期不足，这已成为限制杉木人工林可持续经营的关键因素之一。植物根际的溶磷菌可以将土壤中难溶性矿物磷溶出，提高土壤有效磷含量，并为植物根际提供较好的磷素营养环境。研究表明，施用溶磷微生物肥料能够改善作物磷素营养，进而提高作物产量和质量，并且缓解长期施用化学肥料引起的土壤退化、板结等问题。因此，筛选和鉴定杉木根际溶磷菌，是开发杉木专用微生物菌肥，提高杉木人工林可持续经营水平的重要途径[25]。因此本试验从福建省南屿林场杉木人工林根际土壤中筛选获得了10株溶磷菌，3株优势溶磷菌CX−2、CX−5和CX−7分别隶属于伯克氏菌属的副伯克氏菌、芽孢杆菌属的苏云金芽孢杆菌和微球菌属的云南微球菌。其中，CX−2、CX−5和CX−7分别对磷酸三钙、磷酸铁和磷酸铝具有较好的溶磷效果，液体培养7 d后溶磷比率分别为11.08%、10.38%和12.12%。相较于王春红等[26]在大豆根际土壤中筛选的溶磷菌溶磷量显著增加，同时也高于赵小蓉等[27]报道的溶磷菌的溶磷量，同时发现了鲜有报道的云南微球菌和孢子型乳酸菌作为新型溶磷菌株，此外3种菌株不仅对一种难溶性磷源表现出较强的溶解效果，对于其他2种无机磷源也具有一定的降解能力，CX−2对于磷酸铝和磷酸铁溶解量达到8.31%和9.69%，CX−5对于磷酸铝溶解量达到9.46%，CX−7对于磷酸铁和磷酸三钙溶解量达到8%以上。对于菌肥材料来讲较为适宜和平衡。且在环境pH为5～6和温度为20～30 ℃下表现出稳定的溶磷能力，可以作为杉木专用溶磷微生物菌肥研制的优质菌株。

其中，在所获得的杉木根际土壤溶磷细菌中，伯克氏菌属细菌占比最大，对3种难溶性磷的降解均在8%以上。伯克氏菌属细菌在植物根际土壤中广泛存在，且该属中有多个菌种已被发现有较强的溶磷能力。管国强等在作物根际土壤中筛选出一株洋葱伯克霍尔德氏菌，并发现使用草酸铵作为氮源供溶磷菌发酵培养能使其发挥更好的溶磷能力[28]；刘云华等从磷矿区植物根围土中分离出伯克霍尔德氏菌，并对其溶磷条件进行了优化[29]。目前研究表明，在溶磷微生物代谢过程中分泌的各种小分子量有机酸能与复合磷酸盐中的钙、铁和铝螯合释放出磷酸根形成稳定的可溶性复合物而被植物体吸收利用[6]，这表明较低的pH条件与溶磷菌的溶磷量息息相关，与本实验结果相符。

此外，对于不同的难溶性磷源，芽孢杆菌属同样表现出较好的降解效果。芽孢杆菌广泛分布在世界各地，能够在土壤、水、空气以及动物肠道等环境中存活，与林木生长相关的包括能够防治植物真菌性病害的益生芽孢杆菌、具有很高杀虫活性的苏云金芽孢杆菌以及制作微生物菌肥的地衣芽孢杆菌等。同时，许多芽孢杆菌也具有难溶性磷的降解活性。邢芳芳等从玉米（Zea mays）根际土壤中筛选出一株地衣芽孢杆菌，且发现其具有非常好的生产性能及抗逆、定殖能力[30]。相较伯克氏菌，芽孢杆菌在微生物菌肥生产应用方面已得到广泛认可，本实验筛选获得具有较强溶磷能力的芽孢杆菌，为制作多功能高效微生物菌肥提供菌种。

本实验还筛选出了具有较好溶解磷酸铝和磷酸三钙的溶磷菌株，经过鉴定为云南微球菌和孢子型乳酸菌。微球菌多存在于土壤和水中，也见于人和动物的皮肤上，为非致病菌。乳酸菌广泛存在于人、畜肠道和许多食品中，不仅可以提高食品的营养价值，还具有特殊生理活性和营养功能。在以往的土壤溶磷菌筛选研究中这两种菌在土壤解磷方面研究甚少，在杉木根际土壤中发挥的功能尚不清晰，极有可能为微生物菌肥的制作提供新材料。

解磷微生物菌肥是提高林木磷素营养的重要发展方向，目前国内外已从林木根际筛选和分离到多种具有高效解磷能力的优质菌株，并已利用芽孢杆菌等具有溶磷功能的细菌研制了微生物菌肥。本研究筛选获得的杉木根际溶磷菌对难溶性无机磷具有较好溶解能力，且在正常土壤环境温度和pH下表现出稳定的溶磷能力，可以作为杉木专用溶磷微生物菌肥研制的优质菌株。微生物菌肥的研制还需要考虑溶磷菌在植物根际的定殖能力、适生能力、多功能特性和对作物促生效果，筛选出在杉木根际溶磷活性高、适生定殖能力强、促生效果好的多功能溶磷菌是杉木微生物菌肥的研究方向。