盐胁迫和温度对桑树种子萌发及幼苗生长的影响

黄 恒付锦雪曹帮华赵文轩郝木征毛培利王甜甜郝迎东张希画谭海涛

（1.山东农业大学林学院黄河下游森林培育国家林业局重点实验室，山东泰山森林生态系统国家定位观测研究站，山东 泰安 271018；2.东营市园林绿化中心，山东 东营 257091；3.山东黄河三角洲国家级自然保护区，山东 东营 257500）

桑树（Morus alba）是我国重要的乡土树种，经济价值高，适应能力强，是防沙治沙、石漠化治理、水土保持、盐碱地治理等的重要生态树种[1]。黄河三角洲地区桑树已有多年的栽植历史[2-3]。野外调查发现，该地区的刺槐（Robinia pseudoacacia）林内有着天然更新的不同树龄的桑树种群，这表明桑树在滨海盐碱地区有着一定的天然更新能力。因此，深入研究桑树种子的耐盐性及与其他环境因子的共同作用，有利于找出在滨海盐碱地区种子萌发阶段的主要限制因子，对促进生态环境建设有着重要意义。种子萌发是实现植物种群更新和物种延续的关键环节，是整个植物最为脆弱的关键阶段之一。盐胁迫和温度是影响植物种子萌发的重要环境因子[4-8]。大量的研究表明，盐胁迫显著抑制了植物种子的萌发[8-14]、萌芽幼苗的大小和胚根的长度[15-16]。但耐盐能力较强植物的种子在低盐下萌发受影响不大[17-20]，甚至有促进作用[14,21]。环境温度是影响种子萌发的另一个重要因子，显著影响萌发过程中种子内部的酶活性、各种代谢反应[11,22]。随温度的增加，种子发芽率（G）、发芽速率增加[11,20,23]，但过高的温度种子萌发会受到抑制[18,24]，这与植物种子萌发的最低、最适和最高温度范围有关[25]。许多研究发现盐胁迫与环境温度对种子萌发有着显著的交互作用[14-15,26]。一些盐生植物充分利用温度和盐浓度的变化形成了适应盐碱地的特有方式，如碱蓬（Suaeda salsa）[18]、紫花苜蓿（Medicago sativa）[10]、沙棘（Hippophae rhamnoides）[27]、锦鸡儿（Caragana turkestanica）[19]、黄花苜蓿（Medicago falcata）[28]、盐节木（Halocnemum strobilaceum）[29]、猪毛蒿（Artemisia scoparia）[14]等。

研究发现桑树有着较强的耐盐萌发能力[30-31]，其耐盐能力与种子的来源地域[32]、品种[17,33]有关。于振旭等[34]研究发现，桑树2年生幼苗在土壤含盐量为1.5‰～4.5‰时部分生理生化指标变化差异不显著。柯裕州[30]发现桑树种子萌发阶段的耐盐能力低于幼苗阶段，对盐分更敏感，盐胁迫显著抑制了桑树1年生幼苗的根系生长发育，降低了根冠比（R/S）。桑树种子萌发的适宜温度为25～35 ℃[27]。桑树种子在滨海盐碱地区萌发过程中会同时受到盐分和环境温度的影响，因此系统研究盐胁迫与环境温度对桑树种子萌发的交互作用有利于阐明其在萌发阶段的适应性。本研究探讨了盐胁迫和温度对桑树种子萌发和幼苗生长的影响，从种子萌发、幼苗生物量（SB）、生物量分配及根系形态上阐明了二者的作用机制，探讨了2种因素共同作用下对种子萌发的影响，以期为桑树林在滨海盐碱地区应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 种子采集与处理

试验用的桑树种子采集于山东农业大学林学实验基地（117°15′E，36°17′N）。桑树的年龄为16 a，主要用于生产桑叶，用来养蚕。株行距一般为1.8 m×0.3 m，每年6月初从距离地面40～50 cm处截干。2018年5月30日采集紫黑色成熟果实，在通风处阴干，筛出种子，挑选饱满种子用于试验。种子千粒质量为1.740 g。

1.2 种子萌发实验设置

将采集的种子分别于不同NaCl浓度和温度下进行萌发试验。NaCl浓度分别为0（CK）、3‰、5‰、7‰，温度分别为21 ℃（Ⅰ）、30 ℃（Ⅱ）和39 ℃（Ⅲ）。将种子于30 ℃水中浸种24 h后用75%乙醇消毒10 min，再用蒸馏水进行冲洗，吸干表面水分，置于已灭菌的培养皿内。种子置入前培养皿内放置灭菌的海绵和滤纸，加入25 mL盐溶液或去离子水使滤纸饱和。每个培养皿摆放40粒种子，4次重复，总共48个培养皿，置于经过消毒的人工智能光照培养箱内进行种子萌发。种子萌发以胚根和种子等长为标志[35]。实验持续21 d，每天观察记录1次，记录每日萌发数和种子萌发起始时间。

培养21 d后结束试验，将幼苗分为地上和根系2部分，每盘选取平均长势的3株幼苗的根用HP Scanjet 8200扫描仪（惠普，中国）扫描，然后用Delta−T Area Meter Type AMB2根系参数分析软件分析扫描图片获取根长（RL）、根系表面积（RSA）和根系直径（RD）。然后将地上部分和根系分放于烘箱内（80 ℃，48 h）进行烘干至恒质量，称量记录干质量。按公式（1）～（5）计算SB、G、平均发芽时间（MGT）、发芽指数（GI）、活力指数（VI）、R/S。

式中：G1为萌发数，N为供试种子总数，n为相应各日正常发芽粒数，D为从种子置床起的天数，Gt为各日净发芽数，Dt为相应发芽日，S为幼苗干质量。

1.3 数据分析

所有数据采用SPSS 17.0软件进行分析。采用双因子方差分析比较了G、MGT、GI、VI、SB、地上部生物量（AB）、根系生物量（RB）、R/S、RL、RSA和根系直径的差异，如果差异显著，再用最小显著差异法（LSD）进行多重比较；同时，将种子萌发和幼苗生长指标利用Pearson Correlation Coefficient法进行了相关分析，分析时显著性差异检验水平为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫和温度对种子萌发的影响

由图1可知，随盐浓度的增加，G、GI和VI都是逐渐降低，MGT逐渐增加；随温度的增加，G和GI都逐渐增加，而VI则是先增加再降低，在温度Ⅱ下最高，MGT则是逐渐降低。由表1可知，盐浓度对G、GI和VI有着极显著影响（P＜0.01），对MGT有着显著影响（P＜0.05）；温度对上述指标都有着极显著影响（P＜0.01）；二者在G、GI、VI上没有显著交互作用，但对MGT有着显著的交互作用（P＜0.05）。

图 1 盐胁迫和温度对桑树种子萌发的影响Fig.1 Effects of salt stress and temperature on germination ofM. albaseeds

不同盐浓度之间，G差异显著（P＜0.05），且表现为CK≈3‰＞5‰＞7‰，MGT为CK≈3‰＜5‰＜7‰（P＜0.05），GI和VI为CK＞3‰＞5‰＞7‰（P＜0.01）。不同温度之间，G和GI为Ⅰ＜Ⅱ＜Ⅲ（P＜0.01），MGT为Ⅰ＞Ⅱ≈Ⅲ（P＜0.05），VI为Ⅰ＜Ⅱ≈Ⅲ（P＜0.05）。在交互作用上，随着盐浓度的增加，温度越高MGT越短。

2.2 盐胁迫和温度对SB及R/S的影响

由图2可知，随盐浓度的增加，SB、RB和R/S逐渐降低，AB波动变化；随着温度的增加，SB、RB和R/S都是温度Ⅱ最高，AB也是波动变化。结合表1可知，盐胁迫和温度都对SB、RB和R/S有着极显著影响（P＜0.01），对AB影响不显著；在交互作用上，二者对SB和AB没有显著影响，但对RB有显著影响（P＜0.05），对R/S有极显著影响（P＜0.01）。

图 2 盐胁迫和温度下桑树SB及分配的变化Fig.2 Changes of biomass and distribution ofM. albaseedlings under salt stress and temperature

表 1 盐浓度和温度对桑树种子萌发和幼苗指标的双因素方差分析Table 1 Two-way analysis of variance ofM. albaseed germination and seedling indexes by salt concentration and temperature

不同盐胁迫之间，SB、RB在CK和3‰下差异不显著，极显著大于7‰（P＜0.01）；R/S在CK下最大（P＜0.01），而在3‰、5‰和7‰之间差异不显著。不同温度之间，温度Ⅱ下有着最大SB、RB和R/S（P＜0.01）。在交互作用上，RB和R/S在温度Ⅱ下随盐浓度增加而降低。

2.3 盐胁迫和温度对幼苗根系形态的影响

由图3可知，随盐浓度的增加，RL、RSA逐渐降低，根平均直径逐渐增加。结合表1可知，盐浓度和温度都对RL、RSA和RD有着极显著影响（P＜0.01），二者对上述指标没有显著的交互作用。不同盐浓度之间，RL在CK下显著大于3‰下（P＜0.05），二者显著大于其他盐浓度（P＜0.05）；RSA在CK和3‰下差异不显著，二者显著大于其他盐浓度（P＜0.05）；RD在CK下最大，其他盐浓度之间差异不显著。不同温度之间，温度Ⅱ下的RL和RSA极显著大于温度Ⅰ和Ⅲ下的（P＜0.01），Ⅰ与Ⅲ差异不显著；温度Ⅰ下的RD极显著大于温度Ⅱ与Ⅲ下的（P＜0.01），Ⅱ与Ⅲ差异不显著。

2.4 种子萌发和幼苗生长指标之间相关分析

由表2可知，在种子萌发指标之间，G、MGT、GI和VI之间都有着极显著的相关（P＜0.01），其中G、GI和VI之间为极显著正相关（P＜0.01），三者与MGT为极显著负相关（P＜0.01）。在幼苗生长指标之间，SB与AB、RB、R/S、RL和RSA成极显著正相关（P＜0.01）。根系特征之间，RB、R/S、RL和RSA之间成极显著正相关（P＜0.01），RB和R/S与根直径之间成显著负相关（P＜0.05），RL和RSA之间成极显著负相关（P＜0.01）。在种子萌发指标和幼苗生长指标之间，G、GI和VI与根直径成极显著负相关（P＜0.01），而MGT与根直径成极显著负相关（P＜0.01）；VI与SB成极显著正相关（P＜0.01），与RB、R/S、RL和RSA成极显著正相关（P＜0.01），与RD成极显著负相关（P＜0.01）。

图 3 盐胁迫和温度下桑树幼苗根系形态的变化Fig.3 Changes of root morphology ofM. alba seedlings under salt stress and temperature

表 2 桑树种子萌发和幼苗生长指标之间相关分析Table 2 Correlation analysis between seed germination and seedling growth indexes ofM. alba

3 结论与讨论

研究发现，随盐浓度的升高，桑树种子的G、GI和VI逐渐降低，MGT逐渐增长，种子萌发受到抑制，这与张国英等[31]对桑树种子萌发的研究结果一致。对油葵（Helianthus annuus）[10,36]、紫花苜蓿[10]、苍耳（Xanthium sibiricum）[11]、地梢瓜（Cynanchum thesioides）和牧豆（Prosopis juliflora）[37]等、黄花矶松（Limonium aureum）[4]、云杉（Picea asperata）[5]、兴安杜鹃（Rhododendron dauricum）[6]、中国石竹（Dianthus chinensis）和常夏石竹（Dianthus plumariu）[9]等植物的研究，也发现种子萌发显著受到盐胁迫抑制。本研究发现桑树种子的G在CK与3‰之间差异不显著。其他对桑树种子萌发的试验发现盐浓度不超过3‰[30-31]或4‰[17,29]对其萌发影响不大，这表明桑树有一定的耐盐能力。随盐浓度增加种子萌发受到抑制的原因，一方面可能是NaCl的单盐毒害加剧，另一方面可能是由于离子浓度增大，渗透作用增强导致[29]。在21 ℃桑树种子的G、GI和VI均为最低，与在低温环境下种子吸水困难，酶活性降低有关[38]。随温度的增加，桑树种子的G、GI和VI显著增加，与油葵[36]、小麦（Triticum aestivum）[26]的研究结果相似。这可能与温度增加，提高了种子内部的酶活性等有关[39]。许多研究发现随温度的增加植物种子的G先增加再降低，其最适发芽温度一般处于受试温度区间的中间值[24,28,40]。在MGT上有着盐胁迫和温度有着显著的交互作用，盐浓度越低，温度越高，MGT越短。种子快速的萌发可以增加幼苗的生长时间，提高幼苗抗逆能力[41]。陈宣等[42]认为25～35 ℃是桑树适宜的发芽温度，表现出明显的喜温特性。桑树种子于5月下旬及6月初成熟，6月份温度较高[43-44]，达到其萌发的最适温度。因此在水分充足的条件下，在土壤含盐量较低的土壤中快速萌发，可能是其适应滨海盐碱地的重要方式。

萌发过程中SB是反映种子活力的重要指标。随着盐胁迫浓度的增加，桑树幼苗的生物量逐渐降低，这与张国英等[31]对桑树种子萌发研究和刘伟娜[45]对刺槐种子研究的结果一致。雷舒涵等[24]也发现盐胁迫显著抑制了7个野生观赏草种子萌发的SB。Vahabinia等[8]发现菊苣（Cichorium intybus）幼苗质量也显著受到盐胁迫抑制。本研究发现桑树幼苗AB随盐浓度增加变化不显著，但RB显著降低，表明盐胁迫抑制根系生长的作用大于地上部分，与祝娟娟等[17]、张国英等[31]的研究结果一致。柯裕州[30]也发现盐胁迫下桑树1年生幼苗的根系受抑制程度明显高于地上部分。在生物量分配上，桑树幼苗的R/S在盐胁迫下逐渐降低，与柯裕州[30]、张国英等[31]的研究结果一致，表明R/S是反应桑树受到盐胁迫危害的较好指标。

随温度的增加（除盐浓度7‰外），桑树SB先增加再降低，在中间温度30 ℃最高。陈宣等[42]也发现桑树的萌芽幼苗鲜质量和干质量都是在中间温度35 ℃最高。王玉芳等[46]发现红花大金元幼苗鲜质量也是先增加再降低，中间温度25 ℃最高。对于SB在超过适宜温度下的降低，陈玉梁[36]认为高温下种子呼吸加强，物质代谢加快，加速了储藏物质的消耗，对幼苗生长造成高温伤害。周洋等[40]认为与温度过高影响了营养物质的合成与传递，对幼苗后期的生长不利有关。在生物量分配上，R/S在中间温度30 ℃最高，而且随盐浓度降低而增加。相关分析表明，SB与RB和R/S成极显著正相关。R/S在盐胁迫下的增加提高了植物的耐盐能力[42]。因此，适当高温提高了桑树种子的耐盐能力。另外，本研究发现在温度30 ℃时，SB较其他2个受试温度高，而在39 ℃时，种子的G最高，这表明桑树在种子萌发和幼苗生长上对温度的适应不完全一致。

根系是植物首先感受土壤环境的器官。大量的研究表明，盐胁迫下植物种子萌发时胚根的生长受到显著抑制[17-18,23-24,31,47]。有研究表明当黄瓜幼苗受到Ca(NO3)2和NaCl胁迫时，RL度和RL均显着下降，但侧根密度和RD明显增加，根尖短而肿大，整根生长成簇，根系活力显著增加[48]。本研究发现桑树幼苗RL在3‰就已经比CK显著降低，RD则是显著增加。随着盐胁迫浓度的增加，桑树幼苗RL、RSA减小，显著抑制了根系的生长发育，这表明根系特征对盐胁迫非常敏感。杜建勋等[33]发现盐胁迫抑制了桑树种子萌发时幼苗根系的长度生长。这与柯裕州[30]对桑树1年生幼苗的研究结果一致。Vahabinia等[8]发现菊苣幼苗RL也显著受到盐胁迫抑制。Mao等[41]研究了盐胁迫下刺槐幼苗的根系发育，发现随着盐浓度的增加RL、RSA逐渐降低。相关分析表明，SB与RL、RSA、RD成极显著相关，表明盐胁迫下根系的发育对幼苗早期生长起到决定作用。随温度增加，种子萌发的胚RL度在地梢瓜[12]、发草[24]上都是先增加再降低。本研究发现，桑树幼苗的RL和RSA都是在中间温度30 ℃最高，根系发育最好，这是在30 ℃幼苗生长最好的重要原因之一。

一些研究发现，盐和温度的交互作用对植物种子的萌发有着重要影响[9,14-15,28-29]，适宜的温度会促进盐胁迫下种子的萌发，提高耐盐能力，如甜高粱（Artemisia scoparia）[15]、石竹[9]和猪毛蒿[14]等。本研究发现，盐和温度的交互作用显著影响了桑树种子发芽的MGT、RB和R/S。对于MGT，盐浓度越低，温度越高，MGT越短。在黄河三角洲滨海盐碱地区，桑树种子成熟时的5—6月份平均气温已达20 ℃以上，已经有着较大的降雨量[44]。在该地区较大的降雨量可以显著降低土壤表层的含盐量[49]。因此，较为适宜的温度下，在降雨作用下土壤含盐量降低，这为桑树种子在野外的快速萌发提供了条件；同时，桑树RB和R/S也是在30 ℃时盐浓度越低数值越大，这使得幼苗的发育良好，有着较强的抗逆能力。因此，桑树种子成熟时的高温和进入雨季后土壤含盐量的降低为其种子快速萌发形成健壮的幼苗提供了条件，这可能是其在野外萌发并形成幼苗的重要原因。

桑树是滨海盐碱地区的重要经济和造林树种。本研究发现，桑树种子有一定的耐盐能力，在较低盐浓度下萌发不受影响，但过高的盐浓度则显著抑制其种子萌发；温度对桑树种子的萌发有着明显的调节作用，提高了盐胁迫下的发芽能力，缓解了盐胁迫，这表明桑树的播种育苗在其种子成熟后的高温夏季进行播种更有利于提高成苗率和苗木质量。盐胁迫下根系比地上部反应敏感，尤其是根系的形态指标，较低的含盐量就能显著抑制根系的发育；适宜的温度提高了桑树种子的抗盐能力，这对探讨其在滨海盐碱地区的天然更新限制机制具有重要的意义。