MT HFR 基因不同位点突变与维吾尔族肺癌患者生存期相关性研究

商勇 周慧芳 刘勋 牙生·沙吉旦

新疆喀什地区第一人民医院呼吸二科844000

由于人口的增长和老龄化,癌症已成为世界范围内的主要死亡原因[1]。肺癌是常见的癌症之一,约占总癌症的18.4%[2]。小细胞肺癌和非小细胞肺癌是肺癌的两种主要病理类型。研究普遍认为,环境风险因素(如烟草和遗传变异)与肺癌的发展有关[3-5]。已有的研究证据表明,血清中高叶酸水平对肺癌有保护作用[6-7]。叶酸代谢参与DNA 甲基化和修复过程,可能预防癌变。此外,叶酸参与的一碳代谢在癌细胞过度增殖中起到重要作 用[8-9]。5，10-亚 甲 基 四 氢 叶 酸 还 原 酶(met hylenetetrahydr of olate reductase,MT HFR)基因多态性可能调节叶酸的表达[10]。通过调节叶酸的表达,MTHFR 基因多态性被认为与肺癌的易感性有关。677C/T 和1298 A/C 是MTHFR 基因中最常见的2个单核苷酸多态性,这些单核苷酸多态性已被确定影响血清叶酸水平和MTHFR 基因活性[11],MT HFR 基因多态性与肺癌风险之间的相关性已被广泛研究;然而,中国新疆维吾尔族人群肺癌病例中的MT HFR 基因多态性分布是否具有一定的地域差异? 本研究通过选取2018年9月至2020年9月在新疆喀什地区第一人民医院收治的维吾尔族肺癌患者进行探究,以期从遗传学的角度为治疗维吾尔族肺癌患者提供更多的理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 前瞻性研究。选取2018年9月至2020年9月在新疆喀什地区第一人民医院收治的维吾尔族肺癌患者50例为试验组;选取同期在该院体检的健康维吾尔族者50名为对照组。其中试验组男28例,女22例;年龄(53.27±4.33)岁,年龄范围为42～73 岁;吸烟史 (25.67±3.57)年。对照组男32 名,女18 名;年龄 (54.38±5.65)岁,年龄范围为42～76岁;吸烟史(24.39±4.48)年。试验组和对照组患者一般资料具有可比性(P值均＞0.05)。

纳入标准:无血缘关系的喀什地区维吾尔族患者;患者生存期≥3个月,一般状态KPS 评分≥60分,无明显的脑、心、肺、肝、肾等主要脏器功能障碍。该研究是根据世界医学协会《赫尔辛基宣言》进行的,并且征得各受试者的知情同意。

排除标准: (1)严重心血管疾病、脑血管疾病,有血栓、栓塞性疾病病史;(2)糖尿病;(3)严重肝肾功能不全;(4)严重营养不良;(5)甲状腺疾病;(6)妊娠以及接受器官移植。

1.2 方法

1.2.1 样本取样 清晨采集试验组和对照组的空腹静脉血标本,所有的血标本在-80 ℃冰箱冻存。1.2.2 DNA 提取 采用北京百泰克生物科技有限公司生产的提取试剂盒进行DNA 抽提。首先严格按照说明书稀释或者混悬各种试剂,并做好标记。然后裂解细胞,加入相应试剂纯化DNA,用微量紫外分光光度计测量提取DNA 浓度及260/280的比值,260/280的比值范围为1.8～2.0时样本方可用于后续实验。提取的DNA 保存于-80 ℃冰箱。

1.2.3 MT HFR 基因多态性检测 MT HFR 基因上第667和1 298位的碱基容易发生点突变,采用限制性片段长度多态性酶切技术检测2组MT HFR基因677C/T 和1298 A/C 多态性分布。引物由北京擎科生物科技公司合成,PCR Mix购自上海近岸蛋白生物科技公司。 (1)PCR 反应体系:总体积为50μl,其中模板DNA 30 ng,正向、反向引物各1.2μmol/L,Mix 25μl,加水补足至50μl。PCR 反应条件:95 ℃预变性30 s后进入热循环,94 ℃1 min,60℃30 s,72℃1 min,循环35次,最后72 ℃延伸5 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。667C/T 和1298 A/C的基本信息及引物序列见表1。 (2)PCR 产物酶切分析MT HFR 基因多态性:在PCR 扩增产物中加入内切酶MboⅡ(日本Takara公司,根据酶切产物的量加入相应体积酶),37 ℃金属浴反应4 h。反应结束后,适当浓度的琼脂糖凝胶电泳进行酶切产物检测,进一步分析纳入患者中3种基因型:野生纯合型、杂合型和纯合突变型。

表1 MT HFR 基因1298 A/C、677C/T 位点扩增引物

1.3 统计学分析 采用SPSS 22.0分析软件进行分析,计算MT HFR 677C/T 和1298A/C 基因突变率,等位基因频率确定维吾尔族肺癌患者中MTHFR 基因多态性。计数资料以频数 (%)表示,组间比较采用χ2检验,Kaplan-Meier分析患者生存预后。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TCGA 数据库中肺鳞状细胞癌和肺腺癌样本MT HFR mRNA 的表达量分析 在TCGA 肺癌样本数据库中,我们发现肺腺癌样本和肺鳞状细胞癌样本中MTHFR均较癌旁组织高表达(肺腺癌:t=2.391,P=0.022 3;肺鳞状细胞癌:t=2.426,P=0.020 5),见图1。

图1 MTHFR 在TCGA 数据库中表达量的分析

2.2 肺癌患者中MTHFR 的表达和患者生存预后分析 进一步通过对MT HFR 的表达量和肺癌患者的预后生存进行分析,结果发现低表达的MT HFR 有助于肺癌患者的生存预后,高表达MTHFR 不利于患者的预后,见图2。

图2 MT HFR 的表达与肺癌患者生存预后的关系

2.3 MT HFR 677C/T 基因型频率及等位基因频率 如表2所示,试验组中MT HFR 677CC 基因型频率为26.0%,677CT 基因型频率为42.0%,677TT 基因型频率为32.0%;对照组中MT HFR 677CC基因型频率为68.0%,677CT 基因型频率为20.0%,677 TT 基因型频率为12.0%,组间比较差异均有统计学意义 (P值均＜0.05)。试验组T 等位基因分布频率高于对照组,C等位基因分布频率则相反,差异均有统计学意义 (χ2=4.352、8.647,P值均＜0.05)。

表2 MT HFR 667C/T 基因型及等位基因的分布频率 [频数 (%)]

2.4 MT HFR 1298 A/C基因型频率及等位基因频率 如表3 所示,试验组中MT HFR 1298 AA 基因型频率是30.0%,1298 AC 基因型频率是38.0%,1298CC基因型频率是32.0%;对照组中MT HFR 1298 AA 基因型频率是64.0%,1298 AC基因型频率是22.0%，1298CC 基因型频率是14.0%,组间比较差异均有统计学意义 (P值均＜0.05)。试验组C 等位基因分布频率高于对照组,差异有统计学意义 (51.0%比25.0%,χ2=4.424,P＜0.05)。

3 讨论

近年来,癌症发生、发展中的遗传易感性位点的研究取得了一定的进展,但是肺癌的遗传因素还未能够完全阐明。本研究对维吾尔族人群中50例肺癌患者和50名健康对照者MT HFR 基因的多态性位点进行检测,分析其多态性在肺癌患者以及健康人群中发生的频率以及通过TCGA 数据库进一步检测该基因在肺腺癌以及鳞状细胞癌中的表达水平和对肺癌患者生存预后的影响。TCGA 数据库显示肺腺癌和肺鳞癌患者中MT HFR 高表达,与低表达组相比,高表达MT HFR 的肺癌患者生存预后较差,表明MT HFR 和MT HFR 基因多态性可能与维吾尔族人群肺癌风险密切相关。

采用限制性片段长度多态性酶切技术检测试验组和对照组患者MTHFR 基因677C/T 和1298A/C多态性,以及组间该基因发生多态性的频率。如表1所示,试验组MT HFR 677C/T 野生纯合型基因型 (CC)的分布频率为26.0%,而对照组为68.0%,显著高于试验组;试验组MTHFR 677C/T杂合突变型基因型 (CT)的分布频率为42.0%,而对照组为20%;试验组MTHFR 677C/T 纯合突变型基因型 (TT)的分布频率32.0%,而对照组为12.0%;试验组和对照组的肺癌患者T 等位基因分布频率分别为53.0%和22.0%,试验组中T等位基因分布频率高于对照组,以上各项组间比较差异均有统计学意义 (P值均＜0.05)。这与Liu等[11]的研究结果具有一致性,肺癌患者的MT HFR 677C/T 纯合突变型基因型较多。章婷等[10]却得出了相反的结论,认为T 等位基因可能降低肺癌的发病风险。以上研究结果提示在不同种族人群中,MT HFR 基因单核苷酸多态性可能与遗传学背景和环境等因素有关。虽然本研究的研究对象均为维吾尔族人群,但是纳入对象可能来自不同的地区,存在一定的地区差异,可能会影响实验结果。

此外,本研究还发现试验组MT HFR 1298 AA型患者有30.0%,MTHFR 1298 AC 型患者有38.0%,MT HFR 1298CC 型患者有32.0%,对照组分别为64.0%、22%和14.0%,组间比较差异均有统计学意义(P值均＜0.05),但仍需更大的样本量证实这一推论。MTHFR 基因变异引起肺癌的机制可能与DNA 和RNA 的甲基化异常有关[11-14]。MT HFR 是叶酸代谢途径中的限速酶,催化叶酸代谢产物5，10-亚甲基四氢叶酸转变为5-甲基四氢叶酸,前者可进一步合成核苷酸,而后者是合成体内通用甲基供体S-腺苷甲硫氨酸的原料之一[15-16]。MT HFR 基因变异致酶活性降低,5-甲基四氢叶酸水平低下,S-腺苷甲硫氨酸的合成减少,进一步引起基因组的异常甲基化[17-19]。综上所述,本研究显示MTHFR 基因677C/T 和1298A/C的单核苷酸多态性在维吾尔族人群肺癌中较常见;同时MTHFR 在肺癌组织中高表达,影响患者的生存预后。因此本研究提示MT HFR 基因的多态性与维吾尔族人群肺癌的发生存在一定关系,MT HFR 有望作为筛选肺癌高危人群靶向分子,也可作为临床早期发现肺癌的预测因子。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

表3 MT HFR 1298 A/C基因型及等位基因的分布频率 [频数 (%)]