木霉不同施用方式对黄瓜膜脂过氧化作用、保护性酶活性及枯萎病防效的影响

宿畅 廉华 马光恕 李梅 高玉刚

关键词木霉;黄瓜;枯萎病;保护性酶;丙二醛;质膜透性

黄瓜是我国主要的蔬菜种类之一。近年来，黄瓜土传病害特别是黄瓜枯萎病在全国各种植区几乎都有发生，严重威胁黄瓜产业的健康发展。该病的病原为尖孢镰刀菌黄瓜专化型Fusarium oxys-porum f.sp.cuculnerinuln Owen（Foc）。长期以来，黄瓜枯萎病的防治以化学农药为主，随着环境安全、食品安全问题的日益严峻，运用生物手段预防和控制植物病害的发生、发展受到广泛关注。

木霉Trichoderma spp.能够拮抗多种植物病原真菌。利用木霉防治黄瓜土传病害已有较多的研究报道。如哈茨木霉T harzianum T2-16对西瓜枯萎病的田问防效达到53.11;棘孢木霉T.as-perellum 437对黄瓜立枯病的防治效果达到76.6%，病情指数从对照的41.5下降到9.7;毕卉比较了不同木霉对黄瓜枯萎病的防治效果，其中长枝木霉T.longibrachiatum TL对黄瓜枯萎病的防效最高，达到75.74%，其次为绿色木霉T.viride TV，防效达到70.76%。此外，木霉还对植物表现出良好的促生作用。

植物对病害都具有一定程度的抵抗能力，称为广义的抗病性。诱导植物抗病性是木霉防治植物病害的主要机制之一。在正常情况下，植物细胞内自由基的产生和消除处于平衡状态，当植物处于病原菌侵染或其他逆境胁迫时，细胞内的自由基平衡就会遭到破坏出现自由基积累，产生丙二醛（malonicdialdehyde，MDA）等产物，从而对植物细胞产生氧化胁迫并导致膜系统损伤，胞内电解质外渗导致细胞的相对电导率增大，因此，MDA含量和相对电导率的高低直接反映了细胞脂质过氧化的程度，常用作判断植物胁迫损伤程度的指标，在植物的抗病应答中发挥重要作用。植物的保护性酶系主要包括过氧化氢酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）、多酚氧化酶（polyphenoloxidase，PPO）、过氧化物酶（peroxi-dase，POD）等，这些酶的活性往往与植物抗病性呈正相关。李欣欣等利用堆肥提取液处理草莓，使草莓POD和PPO活性分别提高了45.45%和39.47%，MDA含量降低了14.83%，对草莓黄萎病的防治效果达到42.23%。张晓梦等利用绿色木霉M1和棘孢木霉M2发酵液的50～100倍稀释液喷施辣椒，显著提高了辣椒叶片中POD、PPO和PAL的活性。目前，利用木霉防治黄瓜土传病害已有较多的研究报道，但木霉施用方式对黄瓜的生长、防御体系以及对病害防效的影响缺乏系统研究。课题组前期筛选了3株对黄瓜枯萎病菌有较强拮抗作用的木霉，分别为棘孢木霉T.asperellum 525、哈茨木霉T.harzianum 610和拟康氏木霉T.pseud-okoningii 886，采用不同施用方式处理黄瓜幼苗，测定其对黄瓜幼苗生长、膜脂过氧化作用、保护性酶活性变化及枯萎病的防治效果，为提高木霉菌剂的防病效果、保障黄瓜安全生产提供指导。

1材料与方法

1.1供试材料

1.1.1供试黄瓜品种

‘长春密刺购自山东泰安市裕园种业有限公司。

1.1.2供试培养基

马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基（PDA）：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂10g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.2。马铃薯葡萄糖液体培养基（PD）：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.2。

1.1.3供试菌株

棘孢木霉T.asperellum 525（T525）、哈茨木霉T.harzianum 610（T610）、拟康氏木霉T.pseud-okoningii 886（T886），由中国农业科学院植物保护研究所木霉菌研究组提供。黄瓜枯萎病病原菌Fu-sarium oxysporum f.sp.cucumebrium Owen（Foc），由中国农业科学院植物保护研究所土传病害生物防治研究组提供。

1.1.4供试土壤

草炭土，过1mm筛后160℃高温灭菌2h，自然冷却后再在160℃下灭菌2h，放凉备用。

1.2菌液的制备

1.2.1木霉孢子悬浮液的制备

在PDA平板上活化木霉T525、T610、T886菌株，28℃培养3d，取菌落边缘5mm菌饼，转接到PDA培养基上，培养7d，待菌丝和孢子长满平板，用无菌水洗下孢子，孢子濃度调整为1.5×10个/mL备用。

1.2.2病原菌孢子悬浮液的制备

在PDA平板上活化培养病原菌Foc，28℃培养3d，菌落边缘取5mm的菌饼5块，接种到100mLPD培养基中，28℃、120r/min振荡培养7d，4层纱布过滤，滤液5000 r/min离心，收集孢子，用无菌水调整孢子浓度为1×10个/mL。

1.3盆栽试验方法

1.3.1试验设计

试验地点位于黑龙江八一农垦大学农学院教学基地日光温室。育苗盘（34.5cm×24cm×11cm）装入灭菌土，黄瓜种子催芽后，每盘播人80粒种子。出苗后，根据苗势保留大小一致的小苗50株。播种后浇无菌水，每次每盘1000mL左右，保证黄瓜正常出苗和生长。

在黄瓜第一片真叶展开时（播种后5d），进行真菌孢子悬液灌根处理，每个育苗盘用量为150mL，即保证黄瓜单株接种量为3mL。试验共设5个处理：1）木霉和病原菌孢子悬浮液同时接种（TF）;2）木霉先接种，2 d后接种病原菌（T-F）;3）病原菌先接种，2 d后接种木霉（F-T）;4）只接种病原菌（F）;5）只接种无菌水（CK）。随机区组设计，每个处理3盘，5次重复。播种后8～14d取黄瓜叶片，每个处理选取15株，其中5株用于测定黄瓜幼苗生长指标，10株用于测定膜脂过氧化和保护性酶活性。

1.3.2试验测定指标与方法

1）生长指标测定：株高，用直尺测定黄瓜苗茎基部到生长点的距离;茎粗，用游标卡尺测定子叶节下1cm处直径。地上部、地下部鲜重用千分之一电子天平测定，植株样品用清水反复冲洗并用吸水纸吸干。

2）膜脂过氧化指标测定：叶片质膜透性采用电导率法，使用DDS-11A型电导率仪;丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法;超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、多酚氧化酶（PPO）活性分别采用氮蓝四唑法、愈创木酚比色法、高锰酸钾滴定法和滴定法测定。

3）黄瓜苗期枯萎病标准：0级，无症状;1级，真叶、子叶黄化或萎蔫面积不超过总面积的50%;2级，真叶、子叶黄化或萎蔫面积超过总面积的50%;3级，叶片萎蔫或枯死，仅生长点存活;4級，全株严重萎蔫，以致枯死。

病情指数=[∑（病级株数×代表级值）/（植株总数×最高代表级值）]×100;

防治效果=（对照病情指数一处理病情指数）/对照病情指数×100%。

1.4数据统计与分析

显著性分析采用DPS 7.05软件完成，图表制作采用Microsoft Excel 2007完成。

2结果与分析

2.1木霉不同施用方式对黄瓜幼苗生长的影响

2.1.1木霉不同施用方式对黄瓜幼苗株高和茎粗的影响

黄瓜播种后14d，分别测定木霉不同施用方式处理的黄瓜幼苗株高和茎粗，结果如图1。只接种病原菌（F）的黄瓜幼苗株高和茎粗最低，分别为6.66cm和2.11mm，显著低于其他处理，木霉处理的黄瓜幼苗株高和茎粗均显著高于F和只接种无菌水的对照CK，表明枯萎病菌对黄瓜幼苗株高和茎粗有明显的抑制作用，施用木霉则能够促进黄瓜幼苗生长。此外，3株木霉的不同施用方式对黄瓜幼苗生长的促进作用存在差异。其中以先接种木霉，2d后接种病原菌的T-F处理的促进作用较大，表明先接种木霉有利于植株的生长，并以拟康氏木霉T886的T886-F处理的黄瓜幼苗株高和茎粗最高，分别为8.23cm和2.62mm。

2.1.2木霉不同施用方式对黄瓜幼苗地上部和地下部鲜重的影响

播种后14d，测定木霉不同施用方式处理的黄瓜幼苗地上部和地下部鲜重，结果如图2。F处理的黄瓜幼苗地上部鲜重和地下部鲜重最低，显著低于CK，分别为1.13g和0.17g，表明枯萎病菌显著降低了黄瓜幼苗的鲜重。木霉处理的黄瓜幼苗地上部鲜重和地下部鲜重均显著高于F和CK，表明木霉能够促进黄瓜幼苗的物质积累。3种不同施用方式中，T-F处理对黄瓜幼苗鲜重的促进作用均高于TF和F-T处理，并以T886菌株的T886-F处理的幼苗地上部和地下部鲜重最高，分别为1.59g和0.48g，表明这3株木霉中，以提前施用T886菌株对黄瓜幼苗的物质积累的促进作用最强。

2.2木霉不同施用方式对黄瓜膜脂过氧化作用和保护性酶的影响

2.2.1木霉不同施用方式对黄瓜幼苗叶片质膜透性的影响

播种后8、10、12、14 d，分别测定木霉不同处理的黄瓜幼苗叶片的叶片质膜透性，结果如图3。病原菌处理F和CK的叶片相对电导率均表现出逐渐上升的趋势，并且F显著高于同期的CK，表明枯萎病菌增加了黄瓜幼苗叶片质膜透性，对细胞膜具有破坏作用。

木霉3种施用方式处理的黄瓜叶片相对电导率均低于F，并且呈现出先升高后降低的变化规律，峰值出现在播种后12d，表明施用木霉能够缓解枯萎病菌对黄瓜细胞膜的破坏作用，降低质膜透性，其中以先接种木霉后接种病原菌处理（T-F）的下降幅度最大，且以T886-F处理的叶片质膜透性最低。在播种后14 d，T525-F、T610-F、T886-F处理的黄瓜幼苗叶片相对电导率分别为37.67%、39.78%和36.95%，分别比F下降了35.79%、32.20%和37.02%。

2.2.2木霉不同施用方式对黄瓜幼苗叶片丙二醛含量的影响

播种后8、10、12、14 d，分别测定不同处理的黄瓜幼苗叶片中的MDA含量，结果如图4。F处理叶片的MDA含量显著高于CK，并逐渐升高，表明枯萎病菌能够造成黄瓜叶片细胞膜的膜脂过氧化作用，提高了叶片MDA含量。木霉不同施用方式处理的黄瓜叶片MDA含量均低于F，呈现出先升高后下降的变化规律，且峰值均出现在播种后12 d，与叶片质膜透性变化规律一致。表明施用木霉能够缓解枯萎病菌对黄瓜幼苗叶片细胞膜的破坏作用。

3株木霉的3种施用方式中，以T-F处理的降幅最大，且以T886的T886-F处理叶片的MDA含量最低。在播种后14 d，3株木霉处理的黄瓜幼苗MDA含量均表现为F>F-T>TF>T-F>CK，T610-F、T525-F和T886-F处理的黄瓜幼苗叶片MDA含量分别为2.38、2.49和2.36"m01/g，分别比F下降了14.08%、10.11%和14.80%。

2.2.3木霉不同施用方式对黄瓜幼苗叶片保护性酶活性的影响

播种后8、10、12、14 d，测定木霉不同处理黄瓜幼苗叶片中的保护性酶活性（图5～8）。F处理叶片中SOD、POD、CAT、PPO活性均呈现先升高后下降的变化规律，最高值出现在播种后12 d。CK叶片中上述酶活性随播种时问的延长，表现出缓慢上升的趋势，在播种后14 d，SOD最高值为387.56 U/g（图5），POD最高值为3.94 u/（g·min）（图6），CAT最高值为2.15 m/（g·min）（图7），PPO最高值为3.72 mg/（g·min）（图8），为播种后8 d的叶片中相应酶活性的1.10～1.97倍。经木霉处理的黄瓜叶片的上述4种酶活性均高于F和CK，并呈现逐渐升高的变化规律，表明施用木霉能够诱导叶片保护性酶活性的提高，提高了黄瓜对枯萎病的抗性。3种施用方式中，以T-F处理的黄瓜叶片中保护l！生酶活性相对最高，并且T886的诱导能力高于T525和T610。播种后14 d，T525-F、T610-F、T886-F处理的黄瓜幼苗叶片SOD活性分别为503.27、496.86 U/g和506.73 U/g，比F分别提高了45.82 9/6、43.96%和46.82%;POD活性分别为4.97、4.82 U/（g·min）和5.06 U/（g·min），比F提高了32.53%、28.53%和34.93%;CAT活性分别为2.54、2.43和2.66 mg/（g·min），比F提高了13.39%、8.48%、18.75%;PPO活性分别为4.19、4.08mg/（g·min）和4.32mg/（g·min），比F提高了8.27%、5.43%和11.63%。

2.3木霉不同施用方式对黄瓜幼苗枯萎病防治效果的影响

黄瓜播种后14 d，3株木霉3种施用方式对黄瓜幼苗枯萎病的防治效果如图9。F处理黄瓜幼苗病情指数最高，为49.39，显著高于其他处理。3种施用方式中，以T-F处理的病情指数最低，说明提前施用木霉，有助于对枯萎病的防治。3株木霉对枯萎病的防治效果均达到64.78%以上，其中T886对枯萎病的防效高于T525和T610，T886-F處理对黄瓜枯萎病的盆栽防治效果最高，达到81.54%。

3讨论

木霉对至少18个属20余种植物病原菌有拮抗作用。利用生防木霉防治镰刀菌引起的植物土传病害已有较多的研究报道。如利用哈茨木霉TH防治黄瓜枯萎病，防治效果达到64.34%，绿色木霉TV菌株对黄瓜枯萎病的防效为47.49%。本研究的3株木霉，均对黄瓜枯萎病具有良好的防治效果，其中拟康氏木霉886的防效好于棘孢木霉525和哈茨木霉610，在应用时，先接种T886，对黄瓜枯萎病的盆栽防效最高，达到81.5%，有重要的田间应用前景。

木霉不仅能够防治植物病害，还对植物具有良好的促生作用，如利用绿色木霉TV处理黄瓜，其地上部分和地下部分鲜重分别比对照增加了42.81%和86.92%木霉GYXM-lpl处理甘蓝，处理后甘蓝植株的总鲜重和总干重分别较清水对照增加了417.60%和762.69%本研究的3株木霉处理的黄瓜幼苗，其地上部鲜重和地下部鲜重都显著高于接无菌水对照，表现出良好的促生作用，与文献报道的结果一致。

当植物受病原菌侵染后，木霉等生防微生物能够诱导植物保护性酶活性提高，增强植物体的抗病防御功能。如利用生防菌TB2处理甘蔗，可提高叶片中PPO、POD、SOD、PAL、CAT等酶的活性，提高了甘蔗对赤腐病的抗性。本研究中，提前施用木霉，有助于提高黄瓜幼苗保护性酶的活性，提高病害的防治效果。同时，SOD、POD和CAT等保护性酶活性下降与MDA积累密切相关，可能互为因果，即一方面由于SOD、POD和CAT活性下降，使有害自由基积累乃至超过伤害阈值，可能直接或者问接地启动膜脂过氧化作用，使MDA含量增加，膜系受损;另一方面，MDA的积累反过来抑制SOD、POD和CAT的活性，从而丧失了保护酶系统的功能，进一步促使膜系损伤加重深绿木霉T2具有降低百合MDA含量、诱导百合抗灰霉病的作用;袁扬等人用木霉处理鸭茅Dactylis glomerata L，能有效降低鸭茅中MDA含量，提高植株的抗病性;赵忠娟等报道，哈茨木霉LTR-2能降低盐碱胁迫下蔬菜幼苗相对电导率和MDA含量，进而提高黄瓜、萝卜和番茄对盐胁迫的耐受性。本研究的3株木霉均能诱导黄瓜幼苗叶片质膜透性和MDA含量显著下降，提高黄瓜对枯萎病的抗病能力，具有与其他生防菌相似的防病机制。

生防菌的施用方式对病害的防治效果有显著的影响，如李纪顺等采用木霉融合子与瓜果腐霉处理番茄，结果显示，二者结合处理或木霉融合子单独处理均可以显著提高番茄叶片中SOD、POD及CAT的活性，并以结合处理的酶活性最大。长枝木霉T115D发酵液可诱导大豆叶片PAL、POD、PPO、SOD和CAT的活性增强，用发酵液和疫霉同时灌根处理对大豆疫病的防效最好，达到51.8%本研究中木霉的3种施用方式中，以先接种木霉后接种病原菌的处理对黄瓜幼苗保护性酶的诱导作用最强，病害的防治效果最好，与莫贱友等、余小兰等等的报道结果类似。推测先接种木霉可使之优先在植物根际定殖，占领营养和空间，提高了对病原菌的拮抗能力，同时木霉提前诱导植物抗性酶使其活性增强，提高了植物的抗病性。因此，在实际应用中，提前施人木霉有利于提高黄瓜幼苗质量，提高防病能力和病害防治效果。本研究为开发高效生防木霉菌剂、指导产品应用、提高防病效果提供了依据。