大丽轮枝菌及激素处理后棉花酵母双杂交文库的构建

许艳 李冉 宋健 王丹 周雷 李俊娇 张丹丹 陈捷胤 戴小枫 杨星勇

关键词大丽轮枝菌;植物激素;酵母双杂交;cDNA文库;互作蛋白

黄萎病是由大丽轮枝菌Verticillium dahliae引起的世界性真菌病害，每年造成棉花、马铃薯、蔬菜等农作物损失数十亿美元，严重威胁农业生产安全。感染黄萎病的植物通常表现出叶片萎蔫、黄化、卷曲或坏死症状，维管束变褐，并随着病程进展最终枯萎死亡。

大丽轮枝菌分泌大量具有毒力的胞外蛋白是成功侵染寄主的重要策略之一，如其分泌的细胞壁降解酶类在侵染寄主过程中通常参与降解细胞壁的作用，表现为毒力功能。另外一类分泌蛋白则参与了病原与寄主互作过程，如大丽轮枝菌的无毒因子Avel能够被番茄的抗性蛋白Vel识别而诱导寄主免疫反应;大丽轮枝菌中小分子量的富含半胱氨酸蛋白VdSCP41能与寄主植物的转录因子CBP60g互作而激发免疫反应。此外，通过在模式植物烟草中瞬时表达大丽轮枝菌分泌的胞外蛋白，还筛选出了多个参与寄主互作的毒力因子，如糖苷水解酶VdEG1和VdEG3、角质酶VdCUTll、小分子量富含半胱氨酸蛋白VdSCP7、坏死和乙烯诱导蛋白NLPs。目前，多个参与病原与寄主互作的效应蛋白已经被鉴定并确定了其在侵染过程中的毒力功能，但其是如何识别寄主或被寄主识别并发挥作用的机制仍不清楚。

酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system，Y2H）是研究蛋白相互作用的常用方法之一，最早在1989年由Fields和Song提出，其原理是利用真核生物转录因子的DNA结合结构域-BD和DNA转录激活结构域AD，如GAL4和GCN4等，将2个待研究的蛋白分别与BD和AD结构域连接并共同导人酵母菌中，若2个蛋白相互作用则转录因子的BD和AD结构域相互靠近，即可以转录激活下游报告基因的表达来检测这种相互作用的发生。除应用于2个已知蛋白间的相互作用的检测外，酵母双杂交体系也广泛应用于与已知蛋白具有潜在相互作用的蛋白筛选。但这一技术在大丽轮枝菌效应子与寄主植物相互作用的研究中很少报道，因此，在明确参与大丽轮枝菌与寄主互作效应子的前提下，通过构建植物寄主酵母双杂交文库并筛选与病原效应子互作的靶标蛋白，对揭示大丽轮枝菌侵染寄主过程的致病分子机理具有重要意义。

本研究以大丽轮枝菌及激素处理的棉花为材料，构建了用于大丽轮枝菌效应子互作蛋白筛选的酵母双杂交文库，并对文库的质量进行评估;以实验室筛选的具有诱导细胞坏死且定位于植物细胞核的效应子VCR1（未发表）为例，通过互作蛋白筛选、基因功能分析和验证进一步评价了构建的酵母双杂交文库的应用价值。本研究建立的棉花酵母双杂交cDNA文库将为大丽轮枝菌效应子互作蛋白的筛选鉴定及深入研究病原与寄主互作分子机制的研究提供有力支撑。

1材料与方法

1.1试验材料

植物材料：海岛棉‘海7124Gossypium barba-dense‘Hai 7124，生长条件为L∥D=14 h∥10h，温度28℃。

菌株：落叶型强致病力大丽轮枝菌Vd991、酵母菌株Y187和Y2H均由本实验室保存，大肠杆菌感受态细胞Transl-T1购自北京全式金生物技术有限公司。

质粒：酵母双杂交所用的诱饵质粒pGBKT7、文库质粒pGADT7、对照质粒pGBKT7-Lam、pGBKT7-53和pGADT7-T购自美国赛默飞公司。

1.2试验方法

1.2.1海岛棉样品处理及RNA提取

大丽轮枝菌于马铃薯葡萄糖琼脂（potato Dex-trose agar，PDA）培养基25℃条件下培养7d，无菌水收集孢子并制备成2×10个/mL孢子悬浮液。取20株2周龄海岛棉幼苗（2片真叶完全展平）浸泡于50mL上述孢子悬浮液，30min后移栽回含有灭菌土的营养钵，处理后分别于12、24、48、96 h和144 h取根部样品液氮速冻，-80℃保存。制备10 mmol/L水杨酸（salicylic acid，SA）、5 mmol/L乙烯利溶液（ethephon，ET）和100mol/L茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA），其中乙烯利用水溶，水杨酸和茉莉酸甲酯用乙醇促溶后用水稀释到目标浓度，3种激素分别喷施于20株上述海岛棉幼苗，进行单独处理，处理后于2、6、12、24、48 h和72 h后取叶片迅速置于液氮中速冻，-80℃保存。RNA提取使用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒（北京原平皓生物技术有限公司），通过1.0%琼脂糖电泳检测提取RNA的完整性，使用Nano-Drop2000检测提取RNA的质量与浓度。

1.2.2酵母双杂交cDNA文库构建

根据检测浓度将大丽轮枝菌和激素处理的所有植株RNA样品等量混合，利用SMARTTM cDNA文库构建试剂盒（美國赛默飞公司）构建酵母双杂交cDNA文库。以上述2μL的RNA为模板合成第1条cDNA链，然后通过LD-PCR扩增cDNA得到第2条链，并利用柱层析剔除250 bp以下的双链cDNA。利用PEG/LiAc法将所得cDNA产物和6μL的pGADT7-Rec线性质粒共转入Y187酵母感受态细胞内，用15mL的NaCl溶液（0.9%）重悬菌体并涂布于缺少亮氨酸（Leu）的酵母培养基（syn-thetic dropout nutrient medium，SD）SD/-Leu培养基，30℃倒置培养3～4d后收集菌体，得到的酵母细胞即为处理样品的酵母双杂交cDNA文库，按1.0mL/管分装于1.5mL离心管中，液氮速冻存于μ80℃备用。

1.2.3 cDNA文库转化效率及滴度检测

从上述重悬菌液吸取100μL并用0.9%NaCl10倍梯度稀释至10，涂布于SD/-Leu培养基后于30℃条件下倒置培养3～4d，通过单菌落数计算转化效率。将无菌水收集的菌体稀释至10、10、10和10，分别吸取50，μL涂布于SD/-Leu培养基上，30℃倒置培养3d，根据单菌落数计算文库滴度。

1.2.4cDNA文库平均插入片段大小及重组率分析

在SD/-Leu平板上随机挑取23个单菌落，使用上游引物（5，-TAATACGACTCACTATAGGGO3）和下游引物（5-AGATGGTGCACGATGCA-CAG-3）进行菌落PCR扩增。扩增条件：95℃预变性3 min;95℃变性30s，55℃退火30 s，72℃延伸2min，扩增34个循环;72℃延伸5min。扩增产物使用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，依据扩增产物片段大小计算cDNA文库的平均插入片段大小，阳性克隆比率以及cDNA文库的重组率。

1.2.5诱饵载体构建

以实验室筛选的定位于寄主植物细胞核、引起细胞坏死的大丽轮枝菌效应蛋白VCR1（未发表）为研究对象，构建诱饵载体并开展酵母双杂交文库的筛选。利用带EcoR I酶切位点的特异性引物（上游引物：5，-CATATGGCCATGGAGGC-CGAATTCATGGCACCAGTCCCGGCT-3;下游引物：5，-AGGTCGACGGATCCCCGGGAATTCG-CATGTGTTGAGCATGCT-3）对VCR1基因进行PCR扩增，EcoR I对诱饵表达载体pGBKT7酶切消化，再通过ClonExpress II One Step Cloning Kit（诺唯赞，南京）将VCR1基因片段连接到pGBKT7上;获得重组质粒pGBKT7-VCRl转入Trans1-T1大肠杆菌感受态细胞，使用pGBKT7载体通用引物（上游引物：5，-TAATACGACTCACTATAGGGC-3;下游引物：5，-TAAGAGTCACTTTAAAATTT-GTAT-3）进行PCR扩增验证。

1.2.6重组诱饵载体自激活及毒性检测

将上述构建的诱饵载体pGBKT7-VCR1及pGBKT7质粒分别转入Y2H酵母感受态细胞，涂布于SD/-Trp、SD/-Trp-His和SD/-Trp-His-Ade培养基，通过转化后酵母细胞在上述培养基上的生长情况检测VCR1的自激活性。将上述转化体系涂布SD/-Trp和酵母膏胨葡萄糖琼脂（YPDA）培养基，通过观察其在平板上生长情况鉴定VCR1对酵母是否具有毒性。

1.2.7酵母双杂交文库的筛选

酵母文库筛选：上述携带有诱饵载体的菌株于30 mL SD/-Trp液体培养基中扩大培养，离心收集菌体并用5mL的SD/-Trp液体培养基重悬，随后与构建的酵母双杂交文库混匀，并于45mL的2×YPDA培养基（卡那霉素，50μL/L）中混匀融合培养，30℃、45r/min振荡培养20h。待观察到有合子出现后继续培养4h，典型的合子呈现三耳突状，分别代表两个母细胞和一个子细胞。之后收集菌体，用0.5×YPDA（卡那霉素，50μL/L）培养液重悬菌体2次，最后定容至10mL。将上述重悬的酵母细胞涂布于直径15cm的SD/-Trp-Leu-His（TDO）培养基上，每个涂布200μL，共50个平板，30℃倒置培养3～5d。将TDO培养基上长势较好的阳性克隆转接到SD/-Trp-Leu-His-Ade（QDO）培养基上，30℃倒置培养观察其生长隋况。

结合效率测定：取上述重悬的酵母菌体100μL，按10倍梯度稀释至10后每个梯度都分别涂布于SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Trp-Leu（DDO）培養基平板上，每种培养基涂5个平板，30℃倒置培养3～5d。待长出菌落后，统计二倍体、文库和诱饵克隆数，在相同稀释倍数的前提下，计算结合效率。结合效率=二倍体克隆数/文库或诱饵克隆数×100%。

潜在互作转化子测序：挑取在SD/-Trp-Leu-His-Ade培养基上正常生长的酵母细胞，于SD/-Trp-Leu-His-Ade液体培养基进行扩大培养，利用pGADT7载体通用引物（上游引物：5，-TAATAC-GACTCACTATAGGGC-3;下游引物：5，-AGAT-GGTGCACGATGCACA-3）扩增转化子的cDNA插入片段并测序分析。

1.2.8潜在互作蛋白基本特性分析

对上述获得的潜在互作转化子序列进行初步生物信息学分析：通过NCBI数据的BlastP比对推测潜在互作蛋白的编码序列;利用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/smart/set-mode.cgi？NORMAL=1）预测编码蛋白的保守结构域;采用WoLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）预测编码蛋白的亚细胞定位;通过SignalP 4.1（http：//WWW.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）预测编码蛋白是否具有信号肽序列特征。

1.2.9互作蛋白验证

对筛选的阳性克隆与本研究的大丽轮枝菌效应蛋白VCR1进行验证：随机选取5个可能定位于细胞核的潜在互作基因，合成全长cDNA序列并构建于pGADT7载体上，将其分别与诱饵载体pGBKT7-VCRl共转化至Y2H酵母感受态细胞中，以pGADT7-T和pGBKT7-53、pGADT7-T和pGBKT7-Lam分别作为阳性和阴性对照，涂布SD/-Trp-Leu（DDO）培养基，30℃倒置培养3～5d。观察SD/-Trp-Leu培养基上酵母的生长情况，将阳性克隆转接到SD/-Trp-Leu-His-Ade（QDO）和SD/-Trp-Leu-His-Ade/X-a-gal（QDO/x）培养基上，30℃倒置培养5～7d后观察生长和显色情况，验证筛选的基因与靶标效应蛋白的互作情况。

2结果与分析

2.1构建酵母双杂交文库的样品处理及RNA提取

‘海7124是抗黄萎病棉花品种，落叶型强致病力大丽轮枝菌Vd991侵染5～6d后病原仍停留在皮层，病原菌无法繁殖扩展;同时，激素SA、ET和MeJA处理下可诱导植物抗病相关基因表达。为构建有效的抗病相关基因诱导表达文库，本研究收集了大丽轮枝菌Vd991侵染以及激素SA、ET和MeJA处理的‘海7124样品，并提取了所有样品的总RNA，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测结果表明28S及18S条带清晰，完整性好。依据紫外吸收光谱检测发现上述提取的RNA样品的ODe60/ODe80在1.97～2.02之间，浓度在500.4～2 086.4ng/μL（图1），表明RNA质量较好，可以用于文库构建。

2.2海岛棉酵母双杂交eDNA文库构建及评价

上述4组处理样品（大丽轮枝菌侵染及3种激素处理）的总RNA等量混合，反转录合成cDNA第一链，使用此cDNA合成双链cDNA（图2a）并利用柱层析剔除250 bp以下的双链cDNA（ds-cDNA）。将获得的ds-cDNA与酵母双杂交文库载体pGADT7获得共转化Y187酵母菌株进行同源重组，最终获得海岛棉在上述4种处理条件下的酵母双杂交文库。用SD/-Leu培养基收集cDNA文库的菌体，得到约130mL菌悬液并分装于1.5 mL离心管，-80℃冻存备用。

文库转化完成后，通过梯度稀释涂布SD/-Leu培养基对酵母文库的转化效率和滴度进行检测。通过统计，稀释至10平板平均菌落数为590个（图2b），计算得酵母文库的转化效率为5.9×10/3μgpGADT7-VCR1，高于1×10/3μg pGADT7-Rec的试验要求，并且文库滴度达到1.18×10cfu/mL，同样高于1×10cfu/mL的文库构建标准。为验证本研究酵母文库插入片段情况，从上述计算转化效率的平板中随机挑取23个菌落进行PCR扩增，结果显示，挑取的克隆菌落均可扩增出插入片段，重组率达100%，并且扩增片段大小分布在300～2000bp之间（图2c）。综上结果说明，本研究构建的大丽轮枝菌及激素处理下棉花酵母双杂交cDNA文库质量良好，可用于后续大丽轮枝菌效应蛋白的筛选鉴定。

2.3大丽轮枝菌效应蛋白VCR1诱饵载体构建

使用pGBKT7通用引物对连接转化后平板上的阳性克隆进行分子鉴定，并以空载体为对照。结果显示，构建的诱饵载体扩增出的条带与空载体扩增出的条带差值大小与VCR1片段大小相近，约580bp，进一步提取构建好的诱饵载体质粒，用EcoRI内切酶进行酶切验证，并进行测序，结果与预期一致，表明大丽轮枝菌VCR1基因成功整合到诱饵载体pGBKT7（pGBKT7-VCR1）（图3a，3b）。为验证VCR1的自激活性，将pGBKT7-VCR1转化至Y2H酵母并涂布于相应培养基上，结果显示转化pGBKT7-VCR1诱饵载体与pGBKT7载体的酵母在SD/-Trp培养基上正常生长，在SD/-Trp-His和SD/-Trp-His-Ade培养基上不生长（图3c），表明VCRl基因在酵母菌株中没有自激活性。同时，含有pGBKT7-VCR1诱饵载体和pGBKT7载体的酵母菌株在YPDA培养基上生长一致（图3d），表明VCR1对Y2H酵母菌株没有毒性。因此，大丽轮枝菌VCR1可以用于下一步与酵母双杂交文库互作蛋白的筛选。

2.4大丽轮枝菌效应蛋白VCR1的候选互作蛋白筛选

使用上述诱饵载体pGBKT7-VCR1筛选文库，经统计SD/-Leu培养基上稀释100倍的菌落数为415个，1000倍的48个，SD/-Trp-Leu培养基上稀释10倍的菌落数为55个，100倍的10个，计算得出酵母双杂交结合效率约为1.33%（图4a）。进一步从SD/-Trp-Leu-His培养基上筛选出生长正常的克隆480个接种于SD/-Trp-Leu-His-Ade培养基上二次筛选，最终获得生长正常的克隆422个，使用pGADT7通用引物对422个克隆进行PCR鉴定，获得插入片段大于500 bp的克隆201个（图4b）。

2.5大丽轮枝菌效应蛋白VCR1的候选互作蛋白验证

根据上述克隆测序结果分析发现，本研究共筛选到了与大丽轮枝菌效应蛋白VCRl潜在互作的蛋白27个（表1）。通过序列比对与功能注释表明，其中18个为假定蛋白（功能未知）。结果显示，效应蛋白VCR1与其中4个潜在互作蛋白（VCR1-IP001、VCR1-IP005、VCR1-IP009和VCR1-IP027）与阴性对照（pGADT7-T+pGBKT7-Lam）仅在SD/-Trp-Leu培养基上正常生长，在SD/-Trp-Leu-His-Ade和SD/-Trp-Leu-His-Ade/X-a-gal培养基上皆不生長;而效应蛋白VCRl和VCRl一IP003与阳性对照（pGADT7-T+pGBKT7-53），在SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu-His-Ade和SD/-Trp-Leu-His-Ade/X-a-gal培养基上均能够正常生长，表明VCRl可以与VCR1-IP003互作（图5）。

3讨论

植物在病原菌侵染时会诱导抗性基因表达来抵御病原菌的侵染。此外，植物激素也可以作为免疫信号分子激活防御反应，如茉莉酸、水杨酸、乙烯等。水杨酸能够激活针对活体、半活体营养寄生物的抗性防卫反应;茉莉酸能够与乙烯协同发挥作用，激活对死体营养病原菌的防御反应。定位于细胞膜上的棉花枯草杆菌酶（subtilase）GbSBT1同时受大丽轮枝菌、茉莉酸和乙烯诱导，并进入细胞质中发挥功能。因此，参与病原与寄主互作的基因往往在病原侵染、激素处理条件下被大量诱导表达。海岛棉对黄萎病具有较高的抗性，部分品种对黄萎病菌免疫，与陆地棉相比，更适用于筛选抗病基因;‘海7124是抗病基因鉴定与功能研究的常用材料。因此，本研究综合采用大丽轮枝菌侵染、激素处理等条件诱导‘海7124抗病相关基因表达，对处理的样品提取RNA并混合构建酵母双杂文库。本研究所构建的文库可以覆盖多种诱导条件下的抗病相关基因，文库抗性相关基因种类和丰度优于单一处理条件下构建的酵母双杂交文库，从而提高了筛选到与大丽轮枝菌效应子互作蛋白的概率。应用本研究构建的酵母文库，成功筛选到诱饵蛋白VCR1的27个潜在互作蛋白。

高质量cDNA文库构建是利用酵母双杂交筛选互作蛋白的关键，酵母文库的好坏直接影响互作蛋白的筛选效率。良好的酵母文库需要有较高的转化效率（>1×10。/3μg pGADT7-Rec）、重组率、较长的插入片段以及足够的文库滴度（>1×10cfu/mL）。有研究报道利用水稻构建的酵母双杂交文库，转化效率达到6.65×10/3μg pGADT7-Rec，重组率为100%。经质量检测，本研究构建酵母文库转化效率为5.9×10/3μg pGADT7-VCRl，连接片段检测重组率为100%，且插入片段分布在300～2000bp;此外，本研究构建的酵母双杂交cDNA文库滴度为1.18×10cfu/mL，约为标准量的10倍。综上结果，本研究利用大丽轮枝菌及激素处理下的混合样品，成功建立了高效的酵母双杂交cDNA文库，这为后续筛选与大丽轮枝菌效应子互作的靶标蛋白提供了重要的材料基础。

酵母双杂交系统是在真核酵母细胞内研究蛋白之问相互作用的一种方法，此方法灵敏度高，应用广泛。本研究应用酵母双杂交技术成功筛选到27个与VCR1潜在互作的蛋白，这表明构建的酵母双杂交文库具有较好的筛选效果。利用棉花测序的基因组信息，分析获得对应基因的全长序列并进行功能预测，发现鉴定的27个潜在互作蛋白中，18个为未知蛋白，其功能尚不明确;其中24个蛋白质均无信号肽。16个潜在互作蛋白预测定位于细胞核，与效应子VCR1在寄主植物的亚细胞定位（细胞核）相同，具有很高的可信度。随机选取5个定位于细胞核的潜在互作蛋白进行回转验证，确证了与效应子VCR1互作的候选蛋白（VCR1-IP003）。上述结果一定程度上客观反映了酵母双杂交技术自身存在假阳性高的局限性，但也说明本研究构建的酵母双杂交文库可以有效应用于病原与寄主互作蛋白的筛选。

综上，本试验成功构建了海岛棉‘海7124在大丽轮枝菌侵染和激素处理下的酵母双杂交cDNA文库，文库具有较高的转化效率和重组效率，并通过大丽轮枝菌效应子VCR1互作蛋白的筛选系统评价了构建的棉花酵母双杂交文库，为后续筛选与大丽轮枝菌胞外蛋白（效应子）互作的靶标蛋白及其互作机理研究奠定了基础。