神经调节蛋白1/转化生长因子β1对血管平滑肌细胞骨架的作用

2021-04-30李海涛林劲韩丽珍王裕岱滕丽峰

实用医学杂志 2021年7期

李海涛林劲韩丽珍王裕岱滕丽峰

海南省人民医院（海南医学院附属海南医院）心血管内科（海口570311）

位于血管壁中膜层的平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）在血管收缩、压力、环境以及损伤过程中均具有重要的作用。由微管、微丝、中等纤维构成的网状结构即为细胞骨架［1-3］。神经调节蛋白1（neuregulin 1，NRG-1）其胞外结构域与表皮生长因子相似，但是其具有较为保守的NRG-1 胞内结构域（neuregulin 1 intracellular domain，NRG-1-ICD）。NRG-1 在被水解后成为活性物质释放到细胞外，NRG-1-ICD 则会进入细胞核内，参与基因表达调控。研究证实在心血管生理及病理中NRG-1 发挥非常重要的作用［3］。转化生长因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）在正常组织细胞中广泛存在，具有多重生物效应。VSMCs 的表型转化与TGF-β1 的基因调控有关［4］。但是，关于NRG-1-ICD 是否参与VSMC 分化以及VSMCs 的功能如何被NRG-1-ICD 影响的研究相对较少，且结论不统一。本次研究以TGF-β1 作为诱导因素为进一步分析NRG-1-ICD 对VSMC 功能的影响机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物选择SPF 级健康雄性C57BL/6 小鼠，周龄8 ～12 周，平均周龄（10.7 ± 1.3）周，本次研究动物均由常州卡文斯实验动物有限公司提供，且本次实验已获得动物伦理委员会批准。

1.2 人主动脉平滑肌细胞培养提前制备好的人主动脉平滑肌细胞，待细胞生长至75%左右时更换为饥饿培养模式，时间为24 h，加入刺激因素的时间为细胞培养进入静止期后，收集培养所获得细胞。

1.3 大鼠主动脉平滑肌细胞选取80 ～100 g 健康雄性SD 大鼠，对大鼠进行麻醉处理，术区进行备皮，分离大鼠胸腹主动脉，采用贴块法进行细胞分离，进行VSMC 培养，选取浓度为10%的FBS进行培养，直至细胞生长至混合后进行细胞消化，加入浓度为0.25%的蛋白酶，实验选择第3 ～5 代细胞。

1.5 主要试剂人血管内皮细胞试剂盒购于厦门慧嘉生物科技有限公司，兔抗NRG-1 多克隆抗体、兔抗NRG-1-ICD 单克隆抗体、鼠抗α-SMA 单克隆抗体均购于武汉爱博泰克生物科技有限公司，鼠抗β-actin 单克隆抗体购于上海酶联生物科技有限公司，Fluorescein-Labeled 荧光二抗、Rhoda mine-Labeled 荧光二抗均购于盖德化工，qRT-PCR 引物、总RNA 提取试剂盒购于Sigma 公司，NRG-1 腺病毒载体、NRG-1-ICD 腺病毒载体购于OMEGA 公司，TRITC-鬼笔环肽购于Invitrogen 公司，HRG-β1购于OMEGA 公司。

1.6 实验仪器高速离心机购于上海舜制仪器制造有限公司，实时荧光定量PCR 仪购于上海精密仪器仪表有限公司，多功能显微镜、精光共聚焦显微镜购于美国Leica 公司，超纯水净化装置购于Milli-Qufplus 公司，紫外凝胶成像系统购于南京顺泰科技有限公司，ECL 化学发光仪购于Bio-rad公司。

1.7 方法

1.7.1 取材处死小鼠，对其动脉血管系统进行处理后，确定血管损伤部位，然后每隔30 μm 进行一次连续切片，张数以10 张为宜，在超出损伤部位2 mm 后停止切片。

1.7.2 Western blot 分析进行蛋白样品制备，对样本蛋白浓度进行测定，根据测定结果将其配制成固定浓度的单本样品，进行蛋白变性后，配胶，经电泳、转膜处理后加一抗、二抗，经反应后进行化学发光法检测，采用对应的图像分析软件进行分析，经曝光后，记录灰度条。

1.7.3 PCR 检测NRG-1mRNA 表达水平对细胞总RNA 进行提取，分析RNA 浓度及纯度，合成cDNA，设计PCR 引物，并合成cDNA，进行PCR 反应。

1.7.4 鬼笔环肽染色法将制备好的细胞接种到孔板中，选择12 孔板，然后进行病毒转染，病毒选择为GFP-NRG-ICD、GFP-NRG、GFP，将CB 刺激因素加入，进行2 h 培养后洗涤，进行15 min 打孔，使用浓度1%的Triton X-100，加入鬼笔环肽，使用TRITC 标记，进行45 min 孵育，冲洗。进行封片处理，加入提前稀释好的DAPI，共聚焦显微镜下观察染色情况，对荧光强度进行记录［5］。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.7.5 免疫荧光共定位分析将制备好的细胞接种到12 孔板上，给予刺激因素TGF-β1，洗涤后进行15 min 打孔，使用浓度1%的Triton X-100 进行。20 min 封闭，使用山羊血清室温封闭，将鼠抗α-SMA 抗体以及兔抗NRG-1-ICD 抗体加入，孵育，采用TRITC 标记羊抗兔二抗，以FITC 标记羊抗鼠二抗，滴加到样本中后进行1 h 孵育，封片观察。

1.7.6 GST pull-down 实验完成转化后的GST空载体第2 天将细胞加入到含氨苄抗性的LB 培养基中，添加IPTG 诱导融合蛋白。离心、沉淀细菌，收集上清，测定蛋白含量。沉淀实验分别转移20 μL GST 珠子于两1.5 mLEP 管中，离心，加2×SDS 上样缓冲液，沸水煮5 min，收集GST 珠子结合物。裂解收集细胞，离心，收集两份珠子结合物，取上清与上述样品一起电泳观察［6］。

1.7.7 统计学方法数据应用SPSS 18.0进行分析，计量资料以（）表示，采用t检验，多组间比较采用方差分析，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 TGF-β1 上调NRG-1 在人主动脉血管平滑肌细胞（HASMC）中的表达经荧光染色后显示，NRG-1 与α-SMA 共定位。经RT-PCR 分析显示，在大鼠平滑肌细胞、人平滑肌细胞以及人内皮细胞中均存在NRG-1 的mRNA 表达。经Western blot 检测，在不同种属的平滑肌细胞中均存在NRG-1 蛋白的表达，具体见图A、B、C。在对血管平滑肌细胞进行分析时发现，在人平滑肌细胞中，NRG-1 的表达随PDGF-BB 刺激时间延长而降低。在给予TGF-β1 刺激时，NRG-1 的表达随PDGF-BB 刺激时间延长而增加，见图1D、E。

图1 TGF-β1 调控NRG-1 在HASMC 中的表达结果Fig.1 TGF-β1 regulates the expression of NRG-1 in HASMC

2.2 在细胞骨架组构中NRG-1-ICD 参与情况分析经鬼笔环肽染色结果分析，对于应力纤维增粗、肌丝成束NRG-1过表达可以起到促进作用。给予TGF-β1 干预，不会影响细胞骨架，但是NRG-1-ICD 过表达可导致细胞骨架呈现束状排列。认为过表达NRG-1可通过NRG-1的ICD结构域来参与细胞骨架的重塑。且过表达的NRG-1 对于乙酰胆碱诱导的细胞收缩可以起到促进作用。具体见图2。

图2 NRG-1-ICD 在细胞骨架组构中参与情况分析结果Fig.2 Analysis results of NRG-1-ICD participation in cytoskeleton organization

2.3 TGF-β1 对NRG-1/NRG-1-ICD 与α-SMA 相互作用的影响经细胞免疫荧光检测，α-SMA、NRG-1-ICD 在未经TGF-β1 处理人平滑肌细胞中呈现低表达情况。在加入TGF-β1 处理后，α-SMA、NRG-1-ICD 表达均呈现明显升高趋势，位置在胞浆。Western blot 分析，在基础水平时NRG-1/NRG-1-ICD 均可与α-SMA 结合，在经TGF-β1 刺激后明显升高。经进一步分析发现，TGF-β1 和NRG-1/NRG-1-ICD 的相互作用可在TGF-β1 作用下变强，见图3。

3 讨论

血管重塑是动脉粥样硬化、高血压以及血管再狭窄等疾病的共同病理学基础，而血管内膜增生是血管重塑的主要病变因素［7-8］。血管平滑肌在血管损伤后由收缩型转变为合成型，在原有细胞功能基础上增加了迁移、增殖能力［9-11］。

NRG-1 具有较高的生物活性，可有效抑制动脉粥样硬化的发生，在缺血性脑组织中NRG-1 对于炎症反应可以起到抑制作用，对MMP-9、IL-1β、ICAM-1 等因子表达可以起到抑制作用［12-13］。NRG-1 的亚型NRG-1β可在心肌细胞里降低I 型、III 型胶原蛋白，NRG-1β可通过刺激副交感神经方式起到心脏保护效果［12，14］。研究还发现NRG-1β在心血管系统中具有抗肾上腺素功能，对于血管舒张起到促进作用［14-16］。有研究指出，注射NRG-1β可有效降低大鼠缺血造成的心脏功能障碍以及脑损伤程度［17-18］。研究发现在心脏发育、结构维持以及心脏功能完整性中，NRG-1 以及其受体均发挥着非常重要的作用［19］。

虽然已有研究指出给予外源性NRG-1 干预，可对PDGF-BB 引起的细胞前移、增殖起到抑制作用［20］，前期研究也已证实TGF-β1 是调节平滑肌标志基因表达的重要细胞因子，但是目前并无给予NRG-1β刺激是否可以调控人平滑肌细胞中NRG-1 表达的研究。本次研究可以发现，NRG-1 在小鼠以及人主动脉平滑肌细胞中均有表达，且在小鼠平滑肌细胞中表达更高。在给予TGF-β1 刺激后，PDGF-BB 可抑制NRG-1 在人血管平滑肌中的表达。对细胞骨架蛋白分析发现，NRG-1-ICD 与细胞骨架稳定性存在密切联系，且其调控作用可能与α-SMA 有关，对于细胞收缩功能起到促进作用。推测可能与NRG-1 的C 端很有结构域有关，而该结构域可以α-肌动蛋白产生相互作用，对骨架蛋白的形成产生影响。

综上所述，在转录和翻译水平上TGF-β1 可上调NRG-1 的表达；在细胞收缩中，TGF-β1 对于α-SMA与NRG-1-ICD之间的表达可以起到促进作用。