专用采血管对血浆中循环游离DNA保存效果的影响*

徐 鹏，段小瑜△，张海梅，原昆鹏

1.威高集团有限公司国家工程实验室，山东威海 264210;2.山东高创医疗器械国家研究院有限公司，山东威海 264210;3.山东威高集团医用高分子制品股份有限公司，山东威海 264210

循环游离DNA(cfDNA)是指存在于人体外周血液中、游离于细胞之外的DNA，包括细胞溶解破裂后释放到血液中的DNA及胎儿细胞和突变细胞释放到血液中的外源DNA。血液中cfDNA被发现已经超过60年了[1]，然而直到1977年LEON和他的同事在癌症患者血液中发现cfDNA水平升高，cfDNA在临床医学中的重要性才被人们所意识到[2]。近几年由于DNA分离提取、定量检测及测序等分子生物学技术的发展，对cfDNA的研究和临床应用也取得突破，尤其在产前诊断、肿瘤疾病的筛查、治疗检测和预后评估等方面表现出令人振奋的应用潜力。

孕妇血浆中的cfDNA在无创遗传病产前诊断中发挥重要作用[3]。研究表明，胎儿和肿瘤细胞来源的cfDNA水平非常低，仅占总cfDNA水平的10%以下[4]，因此cfDNA检测的准确性和可靠性是其后续临床应用的基本保障。在血液标本的体外储存和运输过程中，不可避免地伴随着白细胞基因组DNA的释放及核酸酶对cfDNA的降解[5]，导致特异的cfDNA片段大小和比例发生变化，大量母源DNA的释放会影响胎儿DNA的检出，尤其会增加与母源DNA序列差异不大的胎儿DNA序列的检出[6]。临床检测cfDNA时，阻止基因组DNA污染的一种处理方式是静脉采血后立即处理血样，但这种方式会限制cfDNA作为生物标志物的应用范围，尤其在缺乏血浆分离和低温储藏设备的地区，而使用cfDNA专用采血管采集血液标本，血液标本经常温保存和长时间运输后，仍能从血浆中提取得到高质量的cfDNA，这种专用采血管在无创产前诊断和肿瘤防控中显示出重要作用。不同实验室对血浆cfDNA片段分布进行测序研究，结果一致表明，cfDNA片段大小主要分布在166 bp[7-8]，cfDNA片段大小成为利用PCR技术进行定量检测时首要考虑的因素[9]。本文采用人Leptin基因166 bp片段来研究不同保存时间血浆中cfDNA水平变化情况，与EDTA-K2抗凝管对比，探讨cfDNA专用采血管对延长血液中cfDNA保存时间的效果。

1 资料与方法

1.1仪器和设备 EDTA-K2抗凝管(E)为威高集团产品，cfDNA专用采血管K及cfDNA专用采血管A为两个cfDNA保存管品牌。游离DNA提取试剂盒品牌为海狸生物。荧光定量PCR仪品牌为西安天隆Gentier 96 E。

1.2招募志愿者 志愿者来自威高集团职工，年龄25～30岁，健康的男性和女性各10例，入选的志愿者均被告知并签署知情同意书。

1.3方法

1.3.1血液采集 所有志愿者均空腹进行血液采集，实验分6个时间点采集每例志愿者的血液标本到一支10 mL的EDTA-K2抗凝管和两支10 mL cfDNA专用采血管中，采血量达到管壁标签标示刻度体积，每管采血完毕后立即轻柔倒转颠倒混匀10次，充分混匀血样与保护剂，将所有采血管放置于室温储存。

1.3.2血浆分离 分别在2 h、4 d、7 d、10 d、14 d、15 d 6个时间点取出所有血液标本，颠倒混匀后于4 ℃ 1 600×g离心10 min，转移最上层淡黄色血浆层至已标记的2 mL离心管中。4 ℃，1 600×g，将每个2 mL离心管再次离心10 min，用移液器小心吸取血浆层至新的1.5 mL的离心管中，以上两步转移操作需注意移液器枪头不要触碰到白膜细胞层和暗红色沉淀。

1.3.3磁珠法抽提cfDNA 取1 mL血浆样品按照游离DNA提取试剂盒的说明书要求进行cfDNA的提取，对制造商推荐的方案稍加修改，将蛋白酶K 60 ℃处理时间从10 min增加到1 h，使与DNA结合的蛋白质降解,DNA充分游离，以逆转化学固定的影响。用55 μL预热缓冲液洗脱cfDNA，并在-80 ℃条件下保存。

1.3.4血浆总cfDNA水平检测 使用Thermo NanoDrop OneC分光光度计检测从血浆中提取的总cfDNA水平。

1.3.5实时荧光定量PCR(q-PCR)定量检测cfDNA水平 采用q-PCR方法，通过已知浓度Leptin基因标准品CT 值与其浓度的对数绘制标准曲线，准确定量人Leptin基因166 bp片段在不同时间点的水平变化来研究血浆中cfDNA的水平变化趋势，上游引物和探针的序列来自参考文献[10]，下游引物使用Primer Premier 5软件设计的序列。Leptin上游引物：5′-CAGTCTCCTCCAAACAGAAAGTCA-3′，下游引物：5′-CGGAGGTTCTCCAGGTCGTTGGATA-3′；Taqman探针：5′-(FAM)bCGGTTTGGACTTC(MGBNFQ) -3′。

Leptin标准品、引物和探针均由上海生工生物工程股份有限公司合成，标准品倍比稀释成2×102～2×108copy/mL，引物和探针的终浓度为500 nmol/L。体系中引入UDG酶和热启动DNA聚合酶，预防PCR扩增产物的污染，抑制在低温条件下的非特异性扩增，两种酶在体系总的量为0.5 U和2.0 U。PCR反应采用20 μL的反应体系，PCR热循环条件：50 ℃ 2 min，94 ℃ 10 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s共45个循环。每个标本设置3个复孔，设置3个无模板对照孔。

2 结 果

2.1血浆总cfDNA水平的检测结果 血液采集到采血管后，室温保存2 h、4 d、7 d、10 d、14 d、15 d，采血管中血浆总cfDNA的水平变化呈现出明显差异(表1)。EDTA-K2抗凝管中总cfDNA水平在室温存放至4 d时，与2 h总cfDNA水平相比降低，差异有统计学意义(t=45.727，P=0.014)。储存7～15 d时，与2 h总cfDNA水平相比升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。两种cfDNA专用采血管中的血浆总cfDNA水平在10 d内保持稳定，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 不同采血管对血浆总DNA水平保存效果的影响

2.2q-PCR检测不同保存时间血液标本cfDNA水平 血液标本采集到3种采血管后室温存放2 h、4 d、7 d、10 d、14 d、15 d，cfDNA水平有差异，结果如图1。EDTA-K2抗凝管中的血浆cfDNA在4、7、10、14、15 d时，相较于2 h时的水平明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，整个储存周期cfDNA水平波动式上升。两种专用采血管中的血浆cfDNA水平在4、7 d时，相较于2 h的水平略微降低，但差异无统计学意义(P>0.05)；在10、14、15 d时的血浆cfDNA水平，相较于2 h 的水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。

注：E为EDTA-K2抗凝管，K为专用采血管K，A为专用采血管A。

3 讨 论

cfDNA作为新的生物标志物，其水平和组分的稳定性对后期的临床检测至关重要。无创产前诊断、胎儿性别的确定[9]、肿瘤学监测及RhD阴性母亲的RhD基因型检测是cfDNA检测的主要应用领域[10]。有效利用cfDNA靶点作为生物标志物的一个主要技术挑战是对稀有靶点进行量化，由于cfDNA的水平在血浆中的比例非常低，血浆分离离心力过大，白细胞破裂释放DNA，都会进一步减少胎儿或者肿瘤来源cfDNA的比例[11-12]，最小化白细胞的破裂和核酸酶的降解是稳定保存血液标本中目标cfDNA比例的有效方式。cfDNA专用采血管的应用很大程度上解决了血液保存时间的限制，使得缺乏相应提取和检测设备的地区能够进行异地血样检测。

q-PCR是目前定量检测cfDNA水平的主要方法，检测机体中广泛分布且稳定出现的靶序列，定量分析cfDNA的水平变化。Leptin基因位于7号染色体上，且存在于所有人体细胞中，通过血浆中Leptin基因的水平变化能够反映不同采血管对cfDNA保存效果的影响。

本研究对比了EDTA-K2抗凝管与cfDNA专用采血管对于cfDNA保存效果的影响，EDTA-K2抗凝管中cfDNA的水平在第7、10、14、15天明显升高，表明在血液标本的长期保存过程中不断有内源DNA释放造成的污染，在第4天，cfDNA水平降低，表明在EDTA-K2抗凝管血液保存前期，核酸酶对cfDNA的降解作用强于内源DNA的污染，与之相反的两种专用采血管中cfDNA水平保持稳定，且有逐渐减少的趋势，证明专用采血管对稳定血液标本中cfDNA水平在一定时间内有积极的作用，专用采血管能稳定有核血细胞，减少内源DNA的释放，抑制核酸酶对cfDNA的降解作用，从而保持总cfDNA水平的稳定。

通过q-PCR检测血浆中提取的cfDNA，EDTA-K2抗凝管中的血浆cfDNA在4、7、10、14、15 d时，相较于2 h时的水平明显升高，表明cfDNA受到基因组DNA的污染，不同长度片段的分布和比例发生变化，与已有的研究结果一致[13]。两种专用保存管中，cfDNA在保存至4 d和7 d时，cfDNA的水平稳定，保存至10、14、15 d时，cfDNA的水平明显降低，表明两种专用采血管能保持cfDNA水平稳定至少7 d，血液有核细胞的破裂和核酸酶对DNA的降解过程被有效抑制，10、14、15 d时，cfDNA水平降低暗示核酸酶对DNA的降解起到了主导作用。

综上所述，专用采血管能够抑制基因组DNA释放到血浆，同时保持最初的cfDNA水平，对血液标本保存过程中cfDNA的稳定起到积极的作用，稳定有核血细胞，抑制核酸酶的降解活性，对于cfDNA的后续分析和作为生物标志物准确检测奠定了基础。