超声波协同半仿生法提取黑木耳多糖工艺优化

郝慧敏，纵伟

（1.鹤壁职业技术学院，河南 鹤壁 458030；2.郑州轻工业大学食品与生物工程学院，河南 郑州 450002）

黑木耳（Auricularia auricular）又称云耳、木菌，属真菌门、担子菌纲、木耳科、木耳属，性平、味甘，是著名的药食两用真菌[1]，素有“菌中之冠”之称。黑木耳多糖是黑木耳中含有的一种生物活性成分，研究表明其具有抑制肿瘤[2]、调节免疫力[3-4]、降血脂[5]、抗氧化[6]、调节血糖[7]、延缓衰老[8]、抗突变[9]、抗炎[10]、抗菌[11]等功效，在食品和保健医药领域应用广泛。

目前，黑木耳多糖提取方法有热水浸提法、稀碱浸提法、酶法、微波辅助法、超声波辅助法和超微粉碎法等[12-17]，传统的提取方法存在着提取率低、提取时间长、能耗大等缺点[18]。半仿生提取法（semi-bionic extraction，SBE）是一种新的提取技术，它是基于“灰思维”方式，模拟人体胃肠环境，在一定的酸、碱度溶液中依次连续提取，从生物药剂学角度，以模拟给药的方式建立的一种提取技术[19-22]。超声波辅助提取是利用超声的空化效应、热效应和机械振动等作用，加速提取的进行[23]。目前超声波协同半仿生法提取黑木耳多糖的研究还未见报道。因此，本文以黑木耳为主要原料，采用超声波协同半仿生法提取黑木耳多糖，通过正交试验对其工艺进行优化。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑木耳：市售；葡萄糖、柠檬酸、盐酸、无水乙醇、磷酸氢二钠、氢氧化钠、硫酸、苯酚（均为分析纯）：天津市大茂化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

RE-2000B旋转蒸发仪：济南鑫贝西生物技术有限公司；BAS124S分析天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；TDL-50B台式低速离心机：上海安亭科学仪器厂；UV-2450紫外-可见分光光度计：岛津企业管理（中国）有限公司；HH-M4电热恒温水浴锅：上海赫田科学仪器有限公司；PHS-3C酸度计：上海雷磁仪器厂；JY92-ⅡDN超声波细胞粉碎机：宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 超声波协同半仿生法提取黑木耳多糖

根据半仿生法的原理，在模拟人体胃肠道环境的pH值分别为1.4、7.5和8.3的条件下，准确称取经烘干、粉碎后的黑木耳粉样品10 g，分别在上述pH值的溶液中，协同超声波法（一定的料液比、超声功率、超声时间、超声温度）各提取1次，3次提取液合并后在5 000 r/min条件下离心10 min，然后将上清液减压浓缩，浓缩液加3倍体积95%的乙醇后，在4℃冰箱中静置24 h，然后在5 000 r/min条件下离心10 min，沉淀物经真空干燥得到黑木耳粗多糖。

1.3.2 黑木耳多糖的测定

采用苯酚-硫酸法[24]进行测定。

1.3.3 黑木耳多糖提取率的计算

黑木耳多糖提取率根据下列公式计算[25-26]。

式中：c为由标准曲线计算得到的多糖质量浓度，mg/mL；V为定容体积，mL；N为稀释倍数；m为黑木耳干粉质量，g。

1.3.4 单因素试验设计

准确称取10 g黑木耳粉5份，在模拟人体胃肠道环境的pH值分别为1.4、7.5、8.3的条件下，按1.3.1的方法进行超声波协同半仿生法提取黑木耳多糖，考察不同因素对黑木耳多糖提取率的影响。在固定其中3个因素水平的条件下，对余下1个因素设计5个不同水平的试验，固定条件为：料液比 1∶30（g/mL），超声功率400 W，超声温度60℃，超声时间50 min。分别选取料液比 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL），超声功率 100、200、300、400、500 W，超声温度30、40、50、60、70 ℃，超声时间 30、40、50、60、70 min 进行单因素试验。

1.3.5 正交试验

在上述单因素试验的基础上，选取表1中所列的4个因素，采用L9（34）正交试验对黑木耳多糖的提取工艺进行优化。试验水平设计见表1。

表1 正交试验因素水平Table 1 Factor levels of orthogonal experimental design

1.4 数据处理

采用Office进行作图，正交设计助手ⅡV3.1专业版进行正交试验数据分析和方差分析。

(5)基准指代,此类指代与前4类是不同的,也是面向事件的指代与传统指代的不同点,前4类中存在指代的两个要素都是指向同一实体,而此类指代并非指向同一实体,而是以先行要素为基准,来确定照应要素的具体位置,例如“香溪洞景区”←“附近山体”.

2 结果与分析

2.1 单因素试验研究

2.1.1 料液比对提取率的影响

料液比对多糖提取率的影响见图1。

图1 料液比对多糖提取率的影响Fig.1 Effect of solid-liquid ration on the extraction rate

由图1可知，黑木耳多糖提取率随着溶剂量的增加逐渐升高，当料液比达到1∶30（g/mL），再继续增大溶剂的量，多糖提取率变化趋缓。这可能是因为，增加溶剂的量，黑木耳细胞内外的浓度差增大，传质速率就会加快，提取率升高；但当溶剂达到一定量时，溶质溶出基本完全，再继续增加用量，提取率也不再明显升高而是趋于稳定。故取料液比1∶30（g/mL）为佳。

2.1.2 超声功率对多糖提取率的影响

超声功率对多糖提取率的影响见图2。

图2 超声功率对多糖提取率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic power on the extraction rate

由图2可知，多糖提取率随着超声功率的增加呈现先升高后降低的趋势，在超声功率400 W时，多糖提取率达到最大，再继续增加超声功率，提取率反而降低。这可能是因为，增加超声功率，促使超声波的超声和机械效应增强，超声波对黑木耳细胞破壁程度增强，多糖溶出增多，提取率升高；当超声功率大于400 W后，超声波在其声源附近，会产生大量的空化气泡，形成空化屏蔽的环境，导致空化泡不能充分崩解，提取率降低。故取超声功率400 W为佳。

超声温度对多糖提取率的影响见图3。

图3 超声温度对提取率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on the extraction rate

由图3可知，多糖提取率随着超声温度的升高呈现先升高再降低的趋势，在超声温度为60℃时，多糖提取率达到最高，再继续提高超声温度，提取率反而降低。这可能是因为，增加超声温度，溶剂扩散速度加快，多糖溶出增多，提取率升高，当温度大于60℃后，再继续升高温度，多糖会发生降解，提取率降低。故取超声温度60℃为佳。

2.1.4 超声时间对多糖提取率的影响

超声时间对多糖提取率的影响见图4。

图4 超声时间对提取率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic time on the extraction rate

由图4可知，多糖提取率随着超声时间的延长而逐渐升高，当超声时间达到40 min后，再继续延长超声时间，多糖提取率也不会明显升高而是趋于稳定。这可能是因为，增加超声时间，黑木耳细胞破碎程度和数量增加，多糖溶出增多，提取率升高，当超声时间超过40 min后，多糖已溶出完全，不会再明显变化。故取超声时间40 min为佳。

2.2 超声波协同半仿生法提取黑木耳多糖的工艺正交优化研究

正交试验结果见表2。方差分析见表3。

表2 正交试验结果Table 2 The result of orthogonal experimental design

表3 方差分析结果Table 3 The variance analysis results

由表2、表3的数据分析可知，4个因素的影响主次顺序为：A＞C＞B＞D，得出最优组合为 A2B3C2D3。料液比和超声温度对黑木耳多糖提取率的影响达到了显著水平，其它不显著。通过R值分析，超声波协同半仿生法提取黑木耳多糖的最佳工艺参数为：A2B3C2D3。该最优组合与正交试验表2中的较优组合A2B2C3D1不一致，故需进行验证试验，重复试验3次，取其平均值，其结果见表4。

表4 正交试验验证结果Table 4 The result of orthogonal experimental verifies

由表4可知，最终超声波协同半仿生法提取黑木耳多糖的最佳工艺组合为：A2B3C2D3，即料液比 1∶30（g/mL），提取温度60℃，超声功率500 W，超声时间60 min。在此最优组合条件下，得到黑木耳多糖提取率为22.52%（3次平均值）。

3 结论

本试验采用超声波协同半仿生法提取黑木耳多糖，经正交试验优化，最佳工艺参数为：料液比1∶30（g/mL），提取温度60℃，超声功率500 W，超声时间60 min，在此条件下，黑木耳多糖提取率为22.52%，本试验为黑木耳多糖的提取提供一种新的方法。