循环肿瘤细胞在膀胱癌诊疗中的应用价值

苗岳松，刘 杰，刘 昕，王志勇

（承德医学院附属医院泌尿外科，河北 承德 067000）

膀胱癌（bladder cancer）在泌尿系统疾病中比较常见，是严重影响居民生命健康的恶性肿瘤，且膀胱癌的发病率位列全球恶性肿瘤的第9 位[1]，但在我国泌尿系统肿瘤中发病率和死亡率排第1 位[2]。近年来，由于膀胱癌诊疗的技术不断发展，膀胱癌患者的预后生存时间比过去有显著增加，但影响膀胱癌患者无进展生存期的重要因素仍然是肿瘤的复发和转移。研究表明，原发灶肿瘤脱落的细胞能够进入血液循环系统并发生远处转移，而循环系统中肿瘤细胞的细胞学和基因遗传学特征与原发灶内肿瘤的一致[3-6]，原发灶内的肿瘤细胞进入外周血形成循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs），进而导致肿瘤的复发或转移。有学者报道，影像学检查显示的变化较外周血中CTCs 含量的变化滞后，提示循环肿瘤细胞的存在对肿瘤早期发生微转移具有非常重要的意义[7]。已有研究证实，外周血中CTCs 含量可有效预测结直肠癌的预后、进展和总生存率[8]。因此，检测膀胱癌患者外周血中CTCs 含量可辅助诊断膀胱癌。基于此，本研究通过检测膀胱癌患者外周血中CTCs 含量，探究CTCs 阳性率与膀胱癌患者临床特征的相关性，以期发现CTCs 在膀胱癌诊疗中的作用，为临床诊治膀胱癌提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018 年10 月～2019 年6 月河北省承德医学院附属医院泌尿外科研究所收治的92例膀胱肿瘤患者作为试验组，其中男77 例，女22例，年龄38～87 岁，平均年龄（66.10±9.67）岁，中位年龄64 岁。依据术后病理结果，将试验组分为低级别尿路上皮癌30 例，高级别尿路上皮癌62 例，T1+T2期40 例，T3+T4期52 例，非肌层浸润性膀胱癌39例，肌层浸润性膀胱癌53 例。对照组选自我院门诊同期健康体检者20 例，其中男12 例，女8 例，年龄38～82 岁，平均年龄（65.20±10.94）岁，中位年龄68岁。两组性别、年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究已通过河北省承德医学院附属医院伦理委员会审查。

1.2 纳入和排除标准 纳入标准：①未接受过放疗、化疗、免疫治疗及靶向治疗；②无其他部位恶性肿瘤；③膀胱肿瘤患者的组织标本均经过病理确诊为膀胱癌；④试验组均达到相同的手术标准。排除标准：①原发病灶非膀胱的肿瘤；②患有免疫系统疾病；③有结核病史；④随访治疗期间放弃治疗或转院者。

1.3 方法

1.3.1 富集 CTCs 采用上海宝藤医学检验中心开发的SE-iFISH 技术富集及液染。先采用阴性富集法和免疫荧光染色技术从外周血中粗略获取CTCs，再通过非血源性细胞分离介质将外周血中的红细胞和白细胞去除后洗涤，获得CTCs。

1.3.2 液染 选用荧光原位杂交技术染色鉴定CTCs含量。

1.3.3 实验步骤 ①外周血采集：使用8 号采血针和EDTA 抗凝采血管采集大于7.5 ml 的外周血，将样本摇晃混匀。②富集和液染CTCs：取7.5 ml 外周血，离心后弃去上清液，将去上清后的剩余样本倒入A管中；把其中的血细胞堆积到分离介质上；将洗涤A管的洗涤液沿壁倒进带有分离液的B 管；离心后把上清和白膜层放入C 管；将磁珠放于加有清洗液平底离心管，混匀后放在磁力架上，静置后弃上清，重悬至原体积；将清洗后的磁珠加入C 管后，把C 管放在摇床上，摇动；加分离液于D 管中，把C 管中的磁珠混悬液滴在分离介质上；离心后把上清液倒入E 管中，再向E 管中加入清洗液，离心后弃上清，加入清洗液，将液体加至平底离心管中；把平底离心管放在磁力架上后用移液枪将管内液体转移至F 管中；向F 管中加入清洗液，离心后弃上清，混匀细胞加入离心管中，将洗涤F 管后的洗涤液也加入H 管中；加入清洗液离心后弃上清；向细胞液中加入抗原修复液，向H 管中加入配制好的血细胞分析用染色液混合液，室温避光孵育；洗涤液染后的细胞。加入组织固定液，涂片，室温过夜晾干玻片。

1.4 荧光显微镜结果判读 对已进行原位杂交免疫荧光染色后的iFISH CTCs 玻片使用荧光显微镜进行结果判读。荧光信号释义：红色：抗人白细胞单克隆抗体群CD45；橙色：8 号染色体探针CEP-8 探针；绿色：CD31；蓝色：细胞核定位染色剂DAPI。

1.5 结果分析 橙色荧光点为染色体着丝粒探针i－FISH 检测结果。正常非肿瘤细胞为二倍体细胞，胞内两个荧光点；肿瘤细胞为多倍体细胞，胞内大于两个荧光点。蓝色为DAPI 细胞核染色，所有有核细胞均为阳性。细胞无绿色信号，有橙色亮点，符合DAPI+/CD45-/CD31-/CEP8+（多倍体）CTCs 判定标准，见图1。

图1 SE-iFISH 对患者CTCs 的鉴定

1.6 观察指标 所有患者每月电话随访1 次，每隔3个月门诊随访1 次，每隔6 个月复查1 次腹部和盆腔CT。对患者性别、年龄、浸润程度、病理分级、肿瘤分期、多样性进行分析。

1.7 统计学方法 用SPSS 25.0 软件进行统计分析，用Graph Pad Prism 8.0 软件绘制统计图。计数资料以（n，%）表示，组间比较采用χ2检验；计量资料采用[M（P25，P75）]表示，行非参数检验；ROC 曲线分析CTCs 诊断膀胱癌的临界值，并计算其灵敏度、特异度、约登指数。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 术前CTCs 在膀胱癌诊断中的作用 使用ROC曲线判定区分膀胱癌组与对照组的临界值，临界值为1 个CTCs 时，AUC 面积和约登指数最大（AUC=0.951；Youden index=0.868），相应的灵敏度为91.30%，特异度为95.50%，假阳性率为4.50%，假阴性率为8.70%，准确性91.30%。因此，确立CTCs=1个/7.5 ml 为诊断膀胱癌的临界值，术前膀胱癌患者外周血中CTC 的阳性率（CTC ≥1 个/7.5ml）为91.30%，对照组外周血中CTC 的阳性率4.50%，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。

图2 CTCs 对膀胱癌诊断的敏感性

2.2 CTCs 与膀胱癌患者临床特征的关系 92 例膀胱癌患者检测出CTCs 共计515 个，CTCs 范围0～20个/7.5ml，中位数为4 个/7.5ml。不同浸润程度、病理分级的膀胱癌患者CTCs 阳性率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；不同年龄、性别、肿瘤分期、多样性的膀胱癌患者CTCs 阳性率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 CTCs 与膀胱癌患者临床特征的关系（n）

3 讨论

CTCs 主要由原发灶或转移灶自发脱落或因手术操作释放进入外周血中[9]，在肿瘤细胞改变细胞外基质成分的情况下，促使肿瘤细胞进入血管内[10]，形成能提高肿瘤细胞转移能力的CTCs 簇，使少量肿瘤细胞逃避掉失巢凋亡机制存活的肿瘤细胞[11]，从而导致肿瘤的复发及转移。CTCs 在健康人中很少检测到，不过却可以在大多数实体肿瘤患者的外周血液中检测到CTCs[12]。因此，针对血液微转移以及膀胱癌转移的患者，可从循环系统中检测CTCs 直接证明患者存在血液微转移和肿瘤膀胱外转移，进而辅助临床的诊断和治疗[13,14]。目前已有多位学者证实CTCs 可以用于结直肠癌、前列腺癌的疗效监测和预后评价[15]，且采用SE-iFISH 技术检测膀胱癌CTCs 的研究较少。因此，本研究利用SE-iFISH 技术检测检测膀胱癌患者外周血中的含量，探究CTCs阳性率与膀胱癌患者临床特征的相关性，分析其在诊疗方面的应用价值。

本研究显示，试验组CTCs 阳性率为91.30%，高于CellSearch 系统CTCs 的4.90%～47.50%[16，17]，与其他同样采用SE-iFISH 系统检测CTCs 阳性率的研究结果基本一致[18，19]，进一步证实了SE-iFISH 检测系统优于CellSearch 检测系统。本研究结果显示，CTCs的阳性率与浸润程度和病理分级有相关性，与患者的性别、年龄、肿瘤分期、多样性、淋巴结转移均无关，原因可能有以下两点：①临床医师对肿瘤的分期和分级具有一定程度的主观性；②本研究采用的检测技术和肿瘤分组不同有关，有研究采用的流式细胞术是利用荧光标记相应抗体检测CTCs，该法敏感度较低[20]，只能间接反映肿瘤患者外周血液CTCs 的含量，而本研究采用的SE-iFISH 检测系统是将免疫荧光染色法与原位荧光杂交法结合，可直接检测肿瘤患者外周血的CTCs 含量。

本研究还存在一定的局限性：样本量较少，随访时间较短，未能对膀胱癌患者进行生存分析。后期计划进一步加大样本量，动态监测，延长随访时间，探究CTCs 与膀胱癌患者预后的关系。

综上所述，CTCs 检测相较于传统的组织学检测具有相对无创，且重复性好以及节省时间和成本的优点，有利于对患者的诊疗及预后情况观察。CTCs有望成为膀胱癌患者治疗效果的观察指标，检测CTCs 能够对膀胱癌的治疗效果起到较为准确的预测作用。