光照强度和光照周期对笼目海带配子体发育的影响

陈书秀，孙 娟，李 霞，赵 楠，史 良，李晓捷

(山东东方海洋科技股份有限公司，国家海藻与海参工程技术研究中心，山东省海藻与海参技术创新中心，山东省海藻遗传育种与栽培技术重点实验室，山东 烟台 264003)

笼目海带(KjellmaniellacrassifoliaMiyabe)，又称厚叶切氏海带、厚叶解曼藻，属于褐藻门、褐藻纲、海带目、海带科，主要分布于日本北海道函馆和室兰的深水区[1]。笼目海带含有丰富的岩藻多糖，其含量比普通海带高，且其他杂糖含量相对较少，因此是提取岩藻多糖的重要原料。岩藻多糖具有调节血脂、降血糖、降血压、抗肿瘤等生物活性[2]。

笼目海带是一种大型褐藻，一般在冬季和初春进行生长和繁殖，研究其生长发育与环境条件的关系，有利于提高养殖效益，优化养殖结构等。国内外学者对环境因子如温度、光照、营养盐与海带生长发育关系做了一系列的研究[3-8]，但关于光对笼目海带生长发育的影响尚未见报道。光强对海带属种类的生长发育有较大的影响，低温弱光条件下会长期处于配子体阶段，改变生长环境条件，恢复合适的光照强度，海带配子体可以正常发育形成配子体并产生孢子体[9]，海带有孢子体阶段能够耐受较高的光强，随孢子体的变大，其耐受的光照强度减弱[10]。藻类配子或孢子的发生还受光周期的影响，如柏桉藻(Bonnemaisoniahamifera)以隐藏孢子体的状态越夏，在秋冬季短日照时产生孢子；杉藻(Gigartinaacicularis)的雌雄配子体仅在日照短于12 h时形成；礁膜(Monostromagrevillei)的孢子的产生也受光周期的控制[11]。

本研究以笼目海带雌、雄配子体为材料，通过显微观察配子体生长发育状态，计算配子体发育率等，探究不同光照强度及光照周期对笼目海带配子体生长发育的影响，以期为笼目海带配子体克隆育苗技术提供理论支持，为其进一步扩大养殖奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料及培养方法

笼目海带配子体保存条件为温度10℃，盐度31，光照强度10 μmol·m-2s-1，24 h光照。取适量的雌雄配子体分别用300目筛绢过滤，获得含2～5个细胞的细胞段悬浊液，然后按照细胞密度2∶1的比例将雌雄配子体混合均匀，取10 mL悬浊液加入到12 cm(直径)的培养皿中，放置在不同的光照强度、光照周期下进行培养。在海水中添加NaNO3、KH2PO3、柠檬酸铁作为培养液，总有效氮为2 mg/L，有效磷为0.2 mg/L，有效铁为0.05 mg/L。设置不同的光照强度和光照周期进行单因子实验，每个处理组设置3个重复。

根据常见养殖海带品种对光的适应性[10，12]，本实验将光照强度(光照周期均为10L∶14D)设置为：5、10、20、30、40、60、80、100、120 μmol·m-2s-1。光照周期(光照强度均为15 μmol·m-2s-1)设置为L/D：6∶18、10∶14、12∶12、16∶8、20∶4。

1.2 配子体生长、发育指标的测定

在显微镜下观察配子体的生长发育状态，每3天拍照1次，实验周期30 d。

配子体发育率的计算：每个培养皿随机观察10个100×视野，分别统计卵囊形成、排卵、幼孢子体和总细胞数，按卵囊形成数、排卵数和孢子体数之和占总细胞数的百分比计算发育率。

1.3 数据处理

用SPSS 19.0软件对发育率进行单因子方差分析、多重比较(P<0.05表示差异显著)。用Excel软件作图。

2 实验结果

2.1 不同光照强度对笼目海带配子体发育的影响

从图1可以看出，笼目海带配子体在光照强度范围为5～100 μmol·m-2s-1条件下均可进入生殖生长阶段，均出现卵囊、排卵及孢子体(图2d、e、f)。单因子方差分析结果表明，光照强度对笼目海带配子体发育率有显著影响(P<0.05)。多重比较结果如图3所示，培养天数为15 d时，60 μmol·m-2s-1条件下发育率(11.06%)显著高于其他组。培养到第19天 ，各组的孢子体数目显著增加，20～40 μmol·m-2s-1光照强度条件下发育率(42.15%～51.72%)显著高于其他组。培养后期，除高光强100～120 μmol·m-2s-1条件下发育率(42.39%、13.33%)显著低于其他组外，其余光照强度条件下，发育率差异不显著。

2.2 不同光照周期对笼目海带配子体发育的影响

从图4可以看出，笼目海带配子体在5个不同光照周期条件下均可进入生殖生长阶段，均出现卵囊、排卵及孢子体(图2d、e、f)。单因子方差分析结果表明：光照周期对笼目海带配子体发育率有显著影响(P<0.05)。多重比较结果(图5)表明，培养第12～25天时，16L∶8D、20L∶4D光照周期条件下发育率(6.68%～69.87%、6.64%～76.71%)显著高于其他组。培养第28～32天，6L∶18D条件下发育率(23.90%、43.95%)显著低于其他组以外，其余组之间的差异不显著，发育率均可达到60%～80%，其中，光照时间最长的处理组即20L∶4D的发育率(74.54%)最高且孢子体细胞列数最多(图5)。

注：A1、A2、A3分别为6L∶18D第19天、第25天、第32天；B1、B2、B3分别为10L∶14D第19天、第25天、第32天；C1、C2、C3分别为12L∶12D第19天、第25天、第32天；D1、D2、D3分别为16L∶8D第19天、第25天、第32天；E1、E2、E3分别为20L∶4D第19天、第25天、第32天。

注：柱状图上小写字母下标相同数字的为同一组多重个比较，同一组的不同字母表示差异显著(P<0.05)。

3 讨论

藻类对光照强度的需求有一个适宜范围(即补偿光照强度和饱和光照强度之间)，在此适光范围内，光照强度增加，光合作用加快，从而有利于生物量的增加；超过光饱和强度后，光合作用反而减弱以致受到抑制。本实验结果表明，光照强度对笼目海带配子体的发育有显著的影响，笼目海带配子体发育的最适光照强度为20～40 μmol·m-2s-1。国内外专家也做了其他海带配子体的相关研究，杨迎霞等[13]研究结果表明，在4 500 lx光照强度，充气悬浮培养条件下，海带配子体克隆具有较高的瞬时生长率。孙娟等[14]研究表明，多肋藻雌配子体培养光照强度应保持在1 000 lx左右，雄配子体培养光照强度在2 000 lx左右为宜。Lee[15]的研究表明，当光照强度为80 μmol·m-2s-1时，皱海带(L.relifiosa)配子体的繁殖率达到最大。Lüning K等[16]研究表明通常条件下海带配子体在充足光照下会进入生殖生长阶段，在低光下则维持营养生长状态。

本次实验结果表明，在15 μmol·m-2s-1光照强度条件下，较长的光照时间(16L∶8D、20L∶4D)有利于促进配子体的生殖生长进程，促进卵囊的形成、受精卵的排放及孢子体的生长。张鑫等[17]研究了不同光照周期对羊栖菜有性繁殖过程的影响，结果表明，长光照周期可以明显促进卵子的排放，延长卵子的存活时间，提高卵子的受精效率，有利于合子的发育与生长。除此之外，光质、营养盐、温度等也是影响海带配子体生长发育的重要因素。如隋晓伟等[18]研究表明光质对海带配子体的生长和发育具有显著的影响，促进作用最大的是蓝光，其次是绿光，红光可抑制配子体的发育。鞠青等[19]研究表明N∶P>15∶1时会降低海带配子体的形成；王军等[20]研究也表明利尻海带在10℃条件下，雌、雄配子体的成熟度最高；在20℃条件下，配子体不发育。Martins N等[21]发现掌状海带配子体生长的最适温度范围为10～18℃，而发育的最适温度范围为5～15℃。Schreiber E[22]研究表明糖海带配子体生长的最适温度范围为13～18℃，而发育的最适温度为6℃。

另外，各种环境因子对海带配子体的生长发育的影响一般存在着交互作用，如皱海带配子体发育过程中，在光照适宜和营养盐充足的条件下，温度对配子体的发育影响不显著[23]。王军等[20]研究也表明了温度是影响利尻海带配子体成熟的主要因子，照度只是个辅助因子。王潇等[24]研究表明铁和氮磷对海带 ‘黄官1号’配子体的营养生长和生殖生长具有协同促进作用，铁是海带配子体由营养生长到发育成熟再到有性生殖过程中的关键因素。因此，进一步深入研究各环境因子对笼目海带配子体生长发育的影响是利用笼目海带配子体育苗的关键。

4 结论

本文仅利用单因子实验研究了光照强度及光照周期对笼目海带配子体生长发育的影响，结果表明在光照周期为10L∶16D条件下，笼目海带配子体发育的最适光照强度为20～40 μmol·m-2s-1；在光照强度为15 μmol·m-2s-1条件下，笼目海带配子体发育的最适光照周期为16L∶8D、20L∶4D。

综上可知，各种环境因子对海带配子体的生长发育的影响一般存在着交互作用，因此，在笼目海带配子体育苗过程中需要进行多方面的考虑，以期达到最好的育苗效果。