篦子三尖杉内生真菌的分离鉴定和抑菌活性分析

韩洁 桂艳玲 付强 邹颉 赵杰宏

摘 要：珍稀濒危药用植物篦子三尖杉（Cephalotaxus oliveri Mast）是临床白血病药物三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱的重要来源，因此，篦子三尖杉的内生真菌具有潜在的药用价值。通过从篦子三尖杉中分离纯化，筛选出16株外观差异较大的菌株，其中4株无产孢结构。经显微结构和ITS分子鉴定，发现其中11株属于链格孢属。抑菌试验表明，10号菌株对金黄色葡萄球菌的抑制作用较大，11号对白葡萄球菌的抑制作用较大;11号和12号对枯草芽孢杆菌的抑制作用较大;7号对大肠杆菌的抑制作用较大;有5株真菌的抑菌谱较广。筛选的内生真菌具有药用活性，为进一步筛选有药用价值的内生真菌及其代谢产物奠定基础。

关键词：篦子三尖杉;内生真菌;ITS;抑菌活性

Abstract：The rare and endangered medicinal plant Cephalotaxus oliveri Mast is an important source of Harringtonine and Homoharringtonine for clinical leukemic therapy，so that the endophytic fungi of C.oliveri have somewhat potential medicinal value.Here，there were sixteen strains with different appearance screened out by isolation and purification from the leaves and branches of C.oliveri.Among them，there were four strains without sporulation structure，and eleven strains identified as Alternaria by microscopic morphology and ITS identification.The results of bacteriostatic experiment showed that the No.10 strain had greater inhibitory effects on Staphylococcus aureus.The same inhibitory effects were also found for No.11 strain on Staphylococcus albus，the No.11 stain and the No.12 strain on Bacillus subtilis，and the No.7 strain on Escherichia coli.Among which，there were five strains with a wide spectrum of bacteriostatic activity.It provides basis for further screening endophytic fungi for medicinal use.

Keywords：Cephalotaxus oliveri; Endophytic fungi; Internal transcribed spacer; Antimicrobial activity

珍稀瀕危药用植物篦子三尖杉隶属于三尖杉科（Cephalotaxaceae）三尖杉属（Cephalotaxus），为国家二级保护植物，喜温暖湿润的生态环境，多分布在贵州、云南、四川等地海拔300～1500 m的山林中[1]。篦子三尖杉的枝叶含有多种生物碱，其中三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱可以有效地治疗急性非淋巴细胞白血病[2]。随着人们的滥砍乱伐和保护不力，资源短缺等问题持续出现。生活在植物根、茎、叶等器官中的内生真菌，在与宿主植物长期“协同进化”过程中，有的内生真菌也具有了生成类似宿主活性物质的能力，如紫杉醇[3]、细胞松弛素[4]、鬼臼毒素[5]、长春新碱[6]、喜树碱[7]等。通过对篦子三尖杉内生真菌开展分离纯化、显微和分子鉴定，以及抑菌活性分析，筛选出有广谱抑菌活性的内生真菌，为深入研究和开发具有药用价值的内生菌株奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

篦子三尖杉（Cephalotaxus oliveri Mast）采自四川筠连。通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTFATrGATATGC-3′）（自上海生工合成）、DNA 提取试剂盒（天根生物）、DNA聚合酶（大连宝生物）。 大肠杆菌（Escherichia coli），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），白葡萄球菌（Staphylococcus albus）由贵州中医药大学微生物研究室提供。

1.2 方法

1.2.1 内生真菌的分离和观察

采集篦子三尖杉的健壮枝叶，流水冲洗干净后用75%乙醇和次氯酸钠溶液（含7%有效氯） 各浸泡10 min，随后在无菌水中多次清洗干净，再把该枝叶用灭菌手术刀切割成1 cm左右的节段，放在PDA培养基中，放人工培养箱中在28 ℃培养，同时将最后一次冲洗叶片和茎段的灭菌水接种在PDA培养基中，同样条件下培养作为空白对照。培养一周后，分离真菌菌落转移到新鲜的PDA培养基中进行纯化培养。纯化的单菌落培养7 d后，取培养皿观察菌落正反面的形态特征，然后剪取透明胶带粘取菌落中间旺盛生长菌丝于载玻片上，直接显微观察，或者滴加乳酸溴酚棉兰染色液，染色2～3 min后在显微下观察产孢结构或菌丝结构，并进行真菌鉴定。

1.2.2 提取DNA扩增ITS序列

刮取菌丝100 mg放于两支离心管中，在液氮中速冻后研磨成细粉，用DNA 提取试剂盒按照操作说明书提取DNA。取1 μL DNA做模板，加入通用引物ITS1、ITS4各1 μL，再往其中加入 2×Taq PCR Mix 12.5 μL，最后补加ddH2O至25 μL，在PCR仪中进行常规扩增反应[8-9]。扩增产物经凝胶电泳检测后，送上海生工测序。

1.2.3 序列比对和聚类分析

获得的ITS序列在NCBI进行 Blastn（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）比对，选取相似性最高的菌种作为分子鉴定的结果。在MEGA 7.0中，将获得的不同ITS序列进行Align对齐，截去两端不齐序列后，选择Phylogenetic Analysis，点击Phylogeny，选择Construct/Test Neighbor-Joining Tree，更改No.of Bootstrap Replications为1000，在所有参数值都默认时点击Compute，最后查看和下载聚类树。

1.2.4 内生真菌代谢物抑菌活性分析

将液体PDA培养的菌体用纱布过滤，挤出多余水分，并用滤纸吸干，然后在研钵中液氮速冻，快速研磨成粉，称取2 g粉末装入广口瓶中，加入10 mL乙酸乙酯搅拌均匀，静置待用。无粉末的乙酸乙酯作为空白对照。用孔径6 mm打孔器打出滤纸圆片，灭菌后放入提取液中。取四种细菌的水悬液，调OD600为0.7左右，快速倒入不烫手暂未凝固的牛肉膏蛋白胨培养基中，快速摇匀后迅速倒入培养皿中，凝固后获得细菌测试菌培养基，培养细菌1 d后，将提取液饱和的滤纸片接种到培养皿中，各三个重复，培养7 d后观察和比较抑菌圈大小。

2 结果与分析

2.1 内生真菌的形态特征

经过分离和培养，空白对照未发现污染，说明分离的菌株来自内生真菌，共获得了110个内生真菌菌落。根据菌落的外观形态差异，筛选出16种有明显差异的内生菌株。除了1号、3号、13号、15号无产孢结构外，其余编号菌株皆有产孢结构，可以进行初步判断，多数属于链格孢属真菌，分生孢子具有典型的壁砖状结构，孢子表面具横隔和纵隔，横隔较粗（图1）。

2.2 抑菌活性分析

不同内生真菌对不同细菌的抑菌活性不同，除了1号，1、3号真菌对四种细菌都没有明显抑菌圈外，其他真菌至少对1种细菌有抑制作用。对金黄色葡萄球菌有抑制作用的内生真菌是2号、5号、8号、9号、10号，其中10号抑菌圈较大。对白葡萄球菌有抑制作用的是2号、5号、7号、8号、9号、10号、11号，其中11号抑菌圈较大;对枯草芽孢杆菌有抑制作用的是2号、4号、5号、8号、9号、10号、11号、12号、14号，其中11号和12号抑菌圈较大;对大肠杆菌有抑制作用的是7号、10号，其中7号抑菌圈较大（图2）。可以看出，2号、5号和10号的抑菌谱较广和抑菌活性较强。

2.3 内生真菌ITS分子鉴定

将PCR扩增的ITS产物电泳后得到600 bp左右的序列条带。将ITS序列在NCBI blastn比对进行分子鉴定，结合形态学特征和ITS聚类分析（图3），结果显示16株菌株的种群结构多样性较小，16株内生真菌中有11株为Alternaria（链格孢属），其余5株分别为Diaporthe（腐皮壳属）、Fusarium（镰刀菌属）、Phyllosticta（叶点霉属）、Pestalotiopsis（拟盘多毛孢属）、Bjerkandera（黑管菌属）。

3 结论与讨论

通过从篦子三尖杉枝叶中分离纯化，筛选出16株形态各异的内生真菌菌株，经显微特征和ITS分子鑒定，发现其中1号、3号、13号和15号无产孢结构，分别属于黑管菌（Bjerkandera）、腐皮壳菌（Diaporthe）、叶点霉（Phyllosticta）和拟盘多毛孢（Pestalotiopsis），另外4号为镰刀菌（Fusarium），剩余的11株均有产孢结构，均属于链格孢（Alternaria），可见这16个菌株的种群多样性较小，优势菌种为链格孢属真菌，与叶静等[10]、刘兆迪等[11]报道的优势菌株和活性菌株有所不同，可能与材料来源、筛选方法、样品数量等有关。抑菌试验表明，5株非链格孢菌中，只有4号对枯草芽孢杆菌有抑菌活性，其余皆无抑菌活性。抑菌活性主要体现在链格孢菌，其中2号、5号和10号的抑菌谱较广，而且对致病性金黄色葡萄球菌有一定的抑菌活性。可见，个别菌株具有较好的药用潜力。这些内生真菌是否通过“协同进化”也获得生产三尖杉酯碱或高三尖杉酯碱的能力，尚需深入分析。

参 考 文 献：

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