芪连降糖片微生物限度检查方法适用性研究

沈 锐，周 剑，严海元，沈 伟，赵壮志

（1. 重庆市永川食品药品检验所，重庆 402160； 2. 重庆市食品药品检验检测研究院，重庆 401121；3. 重庆市药物过程与质量控制工程技术研究中心，重庆 401121）

芪连降糖片用于治疗2 型糖尿病，有生津止渴、活血化瘀功效，临床多用于消除糖尿病患者的内热，缓解其气虚。其主要成分为黄芪、黄连等中药材，黄芪中黄芪甲苷可降血糖，调血脂，抑制炎症，改善血管病变等；黄连中黄连素能促进胰岛素分泌，防止肝糖原异生［1］。黄芪甲苷对革兰阳性菌和革兰阴性菌均有抑制作用，故黄芪对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希氏菌有强烈的抑制作用，但对酵母菌、黑曲霉等真菌类几乎无抑制作用［2］；同抗菌肽结合后的黄芪对铜绿假单胞菌也有抑制作用［3］。黄连水提物黄连素主要是对革兰阳性球菌（如金黄色葡萄球菌）和革兰阴性短杆菌（如大肠埃希菌）抑制作用明显［4］。由于上述成分的抑菌作用，常规法检查结果不能真实反映该药物的微生物污染情况。本研究中采取稀释法、薄膜过滤法与平皿法进行渐进式研究，建立了芪连降糖片的微生物限度适用性检查方法［5］。现报道如下。

1 仪器、试药与菌株

1.1 仪器

TE2101-L 型电子天平（德国Sartorius 公司）；SPX-150F-Ⅱ型立式生化培养箱（上海龙跃仪器设备公司）；MJ-150-Ⅰ型霉菌培养箱（上海齐欣科学仪器有限公司）；GI80TW 型立式高压蒸汽灭菌器（厦门致微仪器有限公司）；ZWF-110X50 型恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）；MZ-301 型微生物限度仪（杭州美卓生物科技有限公司）；BX53F 型显微镜带成像系统（日本Olympus 株式会社）；VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统（法国生物梅里埃股份有限公司）。

1.2 试药

芪连降糖片（首都医科大学某附属医院，批号为20191201，规格为每片0.56 g）；pH 7.0 无菌氯化钠-蛋 白 胨 缓 冲 液、0.1% 蛋 白 胨 缓 冲 液（0.1% Peptone Buffer）、胰酪大豆胨琼脂（TSA）培养基、胰酪大豆胨液体（TSB）培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）培养基、麦康凯液体（MacConkey Broth）培养基、麦康凯琼脂（MacConkey Agar）培养基，均购自北京三药科技开发公司；氯化钠（成都科隆化学品有限公司）。

1.3 菌株

金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、铜绿假单胞菌［CMCC（B）10104］、枯草芽孢杆菌［CMCC（B）63501］、白 色 念 珠 菌［CMCC（F）98001］、黑 曲 霉［CMCC（F）98003］、大肠埃希菌［CMCC（B）44102］均由中国医学细菌保藏管理中心提供。

2 方法与结果

2.1 微生物计数方法学试验

2.1.1 培养条件与质控标准

按2015 年版《中国药典（四部）》微生物限度检查法的要求，本试验需氧菌在35 ℃下培养72 h；霉菌和酵母菌在25 ℃下培养120 h，均逐天观察；菌落数接种量控制在102cfu／mL 以内。计算回收比值，回收比值＝（试验组菌落数-供试品对照组菌落数）／菌液对照组菌落数，比值须在0.5 ～2.0 范围内。

2.1.2 菌液及溶液制备

菌液：将金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌标准工作菌株用无菌生理盐水制成含菌量≤104cfu／mL 的菌悬液；将黑曲霉孢子用无菌生理盐水加入0.05%聚山梨酯80 制成含菌量≤104cfu／mL 的菌悬液。最终加入供试品溶液中的含菌量≤102cfu／mL。

供试品溶液：称取供试品10 g，以pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液作为稀释液，稀释至100 mL，经45 ℃水浴摇床振荡20 min，将其混匀，制成1 ∶10 供试品溶液。取供试品溶液20 mL，加稀释液80 mL，制成1 ∶50供试品溶液。

2.1.3 计数方法适用性试验

平皿法：取1 ∶10 供试品溶液5 份，分别加入药典规定的5 种试验菌混悬液，使供试品溶液中含菌量≤102cfu／mL，作为试验组；另取1 份作为供试品对照组。菌液对照组，以稀释液替代供试品溶液，分别加入5 种试验菌液。充分溶解混匀后，各移取1 mL 置2 个相应的无菌平皿（90 mm）中，分别倾注TSA，TSB，SDA 培养基。结果金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌回收比值超出0.5 ～2.0 范围，说明1 ∶10 供试品溶液对这两种菌有较强抑菌性；霉菌和酵母菌总数计数中，2 种试验菌回收比值均在0.5 ～2.0 内，说明霉菌和酵母菌计数可采用常规平皿法。详见表1。

稀释法：取1 ∶50 供试品溶液6 份，照平皿法操作。结果试验菌金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌回收比值略有改善，但仍超出0.5 ～2.0 范围，证明稀释法可降低供试品的抑菌性，但未完全消除其抑菌性。详见表1。

表1 需氧菌、霉菌、酵母菌总数预试验结果（平皿法／稀释法／薄膜过滤法，n ＝3）Tab.1 Pre-test results of the determination of the total number of aerobic bacteria，moulds and yeasts（plate method／dilution method／membrane fillration method，n ＝3）

薄膜过滤法：只做需氧菌总数测定方法适用性。取1 mL 1 ∶10 供试品溶液，置50 mL pH 7.0 NaCl-蛋白胨缓冲液中，薄膜过滤，用0.1%蛋白胨缓冲液300 mL 冲洗3 次（每次100 mL），试验组在最后一次冲洗液中加入含菌量≤102cfu 的试验菌；供试品对照组以稀释液代替菌液；菌液对照组以稀释液代替供试品溶液。将菌面朝上的滤膜贴于TSA 培养基平板上（90 mm），每株试验菌平行制备2 个平皿。结果各需氧菌回收比值均在0.5 ～2.0 范围内，表明该方法可用于需氧菌总数测定。详见表1。

2.1.4 验证试验

取样品，按上述方法进行3 次独立试验，验证计数方法适用性。结果金黄色葡萄球菌（TSA）、铜绿假单胞菌（TSA）、枯草芽孢杆菌（TSA）、白色念珠菌（TSA）、黑曲霉（TSA）、白色念珠菌（SDA）、黑曲霉（SDA）的回收率比值依次为0.84，0.89，0.83，0.86，0.83，0.69，0.75，均符合要求。故宜采用取1 mL 1 ∶10 供试品溶液置50 mL pH 7.0 NaCl-蛋白胨缓冲液过滤，每膜冲洗量300 mL 进行需氧菌总数计数；平皿法进行霉菌和酵母菌总数计数。

2.2 控制菌检查方法适用性试验

2.2.1 菌液及溶液制备

将标准工作菌株大肠埃希菌用无菌生理盐水制成菌悬液，加入供试品溶液中的菌落数≤102cfu。同2.1.2项下方法制成1 ∶10 供试品溶液。

2.2.2 方法适用性试验

取2.2.1 项下1 ∶10 供试品溶液10 mL 及≤102cfu试验菌的菌悬液（大肠埃希菌），接种至100，200 mL TSB 培养基中，混匀，作为试验组A 和B；供试品对照组以稀释液代替菌液；菌液对照组以稀释液代替供试品溶液。TSB 培养基35 ℃培养18 h，取1 mL 接种至100 mL 麦康凯液体培养基中，44 ℃培养24 h；取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，35 ℃培养18 h。

2.2.3 适用性试验结果

采用平皿法，以100 mL TSB 培养基作为增菌液，麦康凯液体培养基和麦康凯琼脂培养基平板上均呈阳性，但大肠埃希菌浓度较低；稀释法以200 mL TSB 培养基作为增菌液，阳性明显，菌落生长较好。以经济高效为前提综合考虑，最终以100 mL TSB 培养基作为增菌液，已能满足控制菌检查要求。结果见表2（表中麦康凯液体培养基中，+为浑浊，紫色变黄色；-为澄清，显紫色；+ -为轻微浑浊，且紫色变淡黄色。麦康凯琼脂培养基平板中，+为桃红色典型菌落生长；-为无典型菌落生长；+ -为呈较少桃红色、不透明菌落）。

表2 大肠埃希菌控制菌检查方法适用性试验结果（n ＝3）Tab.2 Results of the suitability tests for the control bacteria of Escherichia coli（n ＝3）

2.2.4 验证试验

取芪连降糖片，进行3 次独立试验。以100 mL 胰酪大豆胨液体培养基作为增菌液，结果可信、有效，表明该方法可行。

2.3 微生物限度检查

按2 次验证试验方法对样品进行微生物限度检查。样品中需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数均低于10 cfu／g，未检出控制菌大肠埃希菌，符合2015 年版《中国药典（四部）》通则1107“非无菌药品微生物限度标准”相关要求。

3 讨论

2015 年版《中国药典》相较2010 年版，在微生物限度检查中改变了加菌方式及培养基，在更贴合国外药典的同时兼顾了中国特色［6］。在供试品制备阶段加入菌液，使菌液和供试液充分混合，更好地模拟了样品污染情况，同时样品中的成分能充分作用于病原菌，更好地反映药物对病原菌是否有抑制作用，但也增加了试验操作的难度［7］。

本品主要成分黄芪和黄连两味药材具有较强的抑菌作用，验证方法的选择中显示，常规法＞培养基稀释法＞培养基稀释-薄膜过滤联用法［8］。本研究中在选择方法时从常规法到稀释法逐步试验，测定需氧菌总数时采用1 ∶10 供试品溶液平皿法，增加稀释液体积，均无法消除供试品的抑菌性。中成药的抑菌性无法选择合适的中和剂消除抑菌性，薄膜过滤法能直接彻底消除抑菌作用，计数结果准确度高［9］。中成药固体制剂中含有大量不溶性辅料，预试验中建立了培养基稀释-薄膜过滤联用法进行冲洗，每膜以300 mL 及500 mL 为冲洗液，结果试验菌均生长良好，最终确定以50 mL pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释，300 mL 0.1%蛋白胨缓冲液冲洗3 次，每次100 mL。选用的方法操作简捷高效，加样回收率好［10］。在控制菌的方法学验证中，很多文献均首要考虑是否呈强阳性，而忽略了在方法学建立时应同时考虑快捷、经济，本试验中对控制菌增菌培养基体积的选择兼顾了以上原则。

在对黑曲霉进行计数时，应逐天观察，由于黑曲霉易蔓延生长，不易计数，所以白色菌丝生长出来就应计数。另外，以稀释液作为空白对照，计数与控制菌检查均应显阴性，否则试验失败需重新进行［11］。2015 年版《中国药典》中非无菌微生物计数主要还是以中成药及化学药为主，未涉及中药材，2020 年版《中国药典》已将中药材纳入其中，越来越多的研究涉及中药饮片的微生物计数检查［12-13］，如杨瑞琦等［14］的肉豆蔻饮片微生物计数研究及李艳等［15］的6 种中药饮片微生物检测状况分析等，为后续不断深入研究奠定了基础。