人工养殖西伯利亚狍肠道微生物组成的雌雄差异

刘金月 刘德凯 王璐瑶 李 响 贾博文 刘艳华

(东北林业大学野生动物与自然保护地学院，哈尔滨，150040)

动物肠道菌群的组成受环境和地理因素的影响，并且在宿主生长和发育等许多方面起着重要作用[1]。在过去的10年里，肠道微生物在健康和疾病中的作用已经成为一个具有重大科学意义和临床研究的重要性领域。在各种生态位中，动物肠道拥有复杂和丰富的微生物群落，是宿主-微生物相互作用的舞台，具有局部和系统的影响[2]。肠道微生物在营养消化吸收、肠道健康和免疫等诸多方面发挥着重要作用，是动物生存和适应环境的关键[3]。大量研究表明，哺乳动物肠道疾病的发生与肠道微生物的结构密切相关[4-6]。肠道微生物的结构受很多因素的影响，例如食性、疾病、生活方式等。

西伯利亚狍(Capreoluspygargus)隶属于偶蹄目(Artiodactyla)，鹿科(Cervidae)，狍属。主要分布于亚洲中部、欧洲、蒙古、俄罗斯等地区。在我国，分布于东北大兴安岭亚区、长白山地亚区、松辽平原亚区，华北区黄淮平原亚区、黄土高原亚区，蒙新区天山山地亚区和青藏区青海藏南亚区；边缘分布于西南区西南山地亚区、华中区东部丘陵平原亚区。目前，狍的养殖主要分布在长白山地区，如白山市、通化县、吉安市等，在河北、内蒙古和新疆地区也有被饲养的狍[7]。目前，我国人工饲养狍的方式主要2种，分别为庭院式养殖和场区式养殖。因为野生狍驯化难度较大，大规模养殖场少，饲养方式落后，养殖技术含量低，预防疾病的体系不完善，没有形成养殖规模和标准化，养殖者对狍科学养殖的知识储备不足，严重制约了狍养殖的科学发展[8]。

肠道菌群是宿主不可分割的组成部分。微生物群在宿主的健康中起关键作用，包括肠道细胞的增殖，病原体的防御，次级代谢产物的产生以及复合碳水化合物的消化。一些肠道微生物与脊椎动物形成了内在的共生关系，这对健康至关重要。通过现代生活方式破坏这些共生关系，可能导致了疾病的增加[9]。反刍动物有独特的消化特性和微生物有助于适应高纤维食品，它们也容易感染多种疾病。家养反刍动物通常以大量的谷物和少量的纤维为食。当反刍动物饲喂缺乏纤维时，体内生理机制的稳态将被破坏，瘤胃的pH值将下降，微生物生态系统将发生改变，并且动物变得更易患病，代谢紊乱，在某些情况下还容易受到传染性疾病的影响[10]。因此研究圈养狍肠道菌群多样性，根据肠道菌群特点，为开展饲料科学化配制的研究工作提供理论依据，科学化养狍，向狍养殖的区域化、规模化和标准化发展。

1 材料与方法

1.1 样本采集

本研究样品取自吉林省舒兰市上营镇狍养殖基地，共采集14只圈养(JY)狍粪便样品。其中雌性8只，雄性6只(表1)。14只狍均为健康个体，在过去的3个月里没有注射过任何抗生素或消炎药。为了保持粪便新鲜、不受污染，狍圈舍在前一天被提前清理干净，所有粪便在脱粪后10 min内立即被收集起来，戴上一次性无菌手套，每收集一个个体粪便样品，换一次一次性无菌手套，以避免人为污染。收集后立即将样品置于含95%酒精的无菌离心管中并密封以避免样品之间交叉污染，然后置于移动式冰箱运输到实验室，并在-80℃冷冻直至DNA提取。

表1 圈养狍个体信息

1.2 DNA的提取和纯化

称取200 mg的样品，放入灭菌的2 mL离心管中，加入1 mL 70%乙醇，震荡混匀，10 000 rpm室温离心3 min，弃置上层液体。加入1×PBS溶液，震荡混匀，10 000 rpm室温离心3 min，弃置上层液体。倒置2 mL管于吸水纸上1 min，直至没有液体流出。将样品管放入55℃烘箱10 min，使残留酒精完全挥发，根据OMEGA试剂盒E.Z.N.A.TMMag-Bind Soil DNA Kit的使用说明书(http：//omegabiotek.com/store/product/soil-dna-kit/)提取DNA。利用Qubit 2.0 DNA检测试剂盒对基因组DNA精确定量，以确定PCR反应加入的DNA量。

1.3 PCR扩增

以纯化的DNA为模板进行PCR扩增。第一轮扩增区域为16S rRNA基因的V3—V4区。PCR所用的引物，341F引物：CCTACGGGNGGCWGCAG，805R引物：GACTACHVGGGTATCTAATCC。第二轮扩增，引入Illumina桥式PCR兼容引物，PCR产物进行琼脂糖电泳检测。利用Qubit 2.0 DNA检测试剂盒对回收DNA精确定量后，按照1∶1的等量混合进行测序。等量混合时，每个样品DNA量取10 ng，最终上机测序浓度为20 pmol。

1.4 数据处理

Illumina MiseqTM得到的原始图像数据文件经CASAVA碱基识别(base calling)分析转化为原始测序序列(sequenced reads)。Miseq测序序列中含有barcode序列，以及测序时加入的引物和接头序列。首先需要去除引物接头序列，再根据PE reads之间的overlap关系，将成对的reads 拼接(merge)成一条序列，然后按照barcode标签序列识别并区分样品得到各样本数据，最后对各样本数据的质量进行质控过滤，得到各样本的有效数据。按相似性将序列分成不同的操作分类单元(OTU)，相似度大于等于97%。使用Mothur进行α多样性指数分析。物种分类分析可以得知样品在各分类水平上的分类学比对情况。β多样性分析，可以很好地反映各分类水平上群落分布组成的异同。距离热图能通过颜色直观地展现样本与样本之间的距离关系，即样本与样本之间的相似程度。X轴和Y轴均为样本，颜色块代表距离值，颜色越红表示样本间距离越近，相似度越高，越蓝则距离越远。通过PCoA可以观察个体或群体间的差异。X轴和Y轴表示两个选定的主成分，百分比表示主成分对样本组成差异的贡献值。不同颜色的点代表不同组中的样本，样本间相似度越高则在图中越聚集，反之样本间相似度越低则在空间距离越远。

2 结果与分析

2.1 测序质量分析

14只狍粪便样品共获得1 216 315条有效序列，平均长度为413.98 bp，雌性样本平均为(78 880±17 035)条序列，雄性样本平均为(97 545±18 018)条序列。基于97%有效序列相似度进行OTU聚类，共获得16 221个OTUs，OTU个数雌性样本平均为(1 145±286)，雄性样本平均为(1 176±394)。

2.2 Alpha多样性分析

根据OTU数据绘制了稀疏性曲线(图1)，Specaccum物种累积曲线(图2)。稀疏性曲线末端趋于平缓，说明测序数据有效反映了狍肠道微生物菌群的多样性。物种累积曲线反映了持续抽样下新OTU(新物种)出现的速率。在样本量为0—10内，曲线急剧上升，表示群落中有大量物种被发现，样本量约为15左右时，曲线趋于平缓，表示微生物的种类不会随狍粪便样品数量的增加而有明显的增加。Alpha多样性指数如2表所示，Ace指数范围2 128.93—772.98，Chao1指数范围2 128.89—785.27，Shannon指数范围5.44—3.78，Simpson指数范围0.07—0.01。

2.3 物种分类分析

2.3.1 门水平菌群组成差异

对于雌性和雄性肠道菌群在门水平上进行了扇形图展示(图3)。其中雌雄主要的3个门类是相同的，分别是Firmicutes(雌55.91%，雄57.19%)，Bacteroidetes(雌30.66%，雄27.50%)，Proteobacteria(雌雄都是6.84%)。还有一些所占比例较小的门类，Verrucomicrobia在雌性所占比例为2.57%，在雄性占0.95%。Spirochaetes在雌性中所占比例为1.69%，在雄性占2.94%。通过对比发现，在门水平上的各类菌群在不同性别狍肠道内存在比例上的差异，前三大优势门类虽然都是Firmicutes，Bacteroidetes，Proteobacteria，但它们所占的比例不同，雌性个体第四优势门类是Verrucomicrobia，而雄性个体是Spirochaetes。同时在个体样本中也发现个体门类组成的差异(图4)，雌性个体JY3和雄性个体JY9除Firmicutes，Bacteroidetes，Proteobacteria这三类菌群外，其他门类菌群所占比例都很低。

2.3.2 科水平菌群组成差异

对于雌性和雄性共有38个主要的科水平细菌分类，进行了扇形图展示(图5)，其中雌雄主要的4个科类是相同的，分别是Ruminococcaceae(雌27.78%，雄31.18%)，Lachnospiraceae(雌17.23%，雄11.61%)，Porphyromonadaceae(雌12.34%，雄9.75%)，Bacteroidaceae(雌10.64%，雄7.92%)。还有一些所占比例较小的门类，Succinivibrionaceae在雌性所占比例为3.73%，在雄性占2.47%。Prevotellaceae在雌性中所占比例为3.04%，在雄性占3.93%。同时通过对比发现，个体间的微生物丰度在科水平上有差异。雌性个体中Ruminococcaceae在JY7和JY13肠道内含量相对较少，Bacteroidaceae在JY7、JY10和JY13中含量较高(图6)。雄性个体中Ruminococcaceae在JY11和JY14肠道内含量较少，Prevotellaceae在JY4中含量较少(图6)。

2.3.3 属水平菌群组成差异

在属水平上，雌性未分类菌群占42.15%，雄性未分类菌群占44.59%(图7)。雌雄狍肠道内前3个主要菌属相同分别为Bacteroides(雌10.63%，雄7.92%)，ClostridiumXIVa(雌7.44%，雄5.57%)，ClostridiumIV(雌3.82%，雄4.57%)。还有一些占比较小的菌群，Succinivibrio(雌3.72%，雄2.47%)，Ruminococcus(雌2.74%，雄2.7%)，Alistipes(雌2.55%，雄2.18%)，Akkermansia(雌2.38%，雄0.73%)等，除上述菌群外，雌性特有的菌属为Roseburia(1.31%)，Alloprevotella(1.05%)，Lachnospiraceae_incertae_sedis(1%)和Coprococcus(0.8%)；雄性特有的菌属为Fusobacterium(1.86%)，Succiniclasticum(1.22%)，Streptococcus(0.9%)和Clostridiumsensustricto(0.69%)。

2.3.4 Beta多样性分析

图8是基于weighted-UniFrac的样品距离heatmap图。图9为不同性别样本的PCoA(principal co-ordinates analysis)分析图。从以上2个图中可以看出，狍样本几乎混在一起，没有明显差异，从而说明beta多样性分析显示雌雄狍肠道内菌群无显著差异。

3 讨论

本研究采用16S rRNA Illumina MiSeq高通量测序技术来研究狍肠道微生物的菌群结构。结果显示：圈养狍雌雄肠道菌群结构无显著差异。在不同物种分类水平上，狍肠道内的优势菌群有些不同。在门的水平上前三大优势菌群是相同的，其中前两大优势菌门为Firmicutes，Bacteroidetes，这与其他先前反刍动物肠道菌群的研究结果一致[11-12]。第三大优势菌门为Proteobacteria，在小熊猫(Ailurusfulgens)中，Proteobacteria被认为是优势物种，它们在消化木质素的主要食物来源中起着关键作用[13-14]。雌性第四优势门类是Verrucomicrobia，而雄性是Spirochaetes。雌雄前4个主要的科类是相同的，所占比例不同。在科水平上雌性第五大优势菌是Succinivibrionaceae，而雄性第五大优势菌为Prevotellaceae。在受饲料限制的动物中，瘤胃中乙酸：丙酸比例(A∶P)的降低与饲料效率的提高和甲烷产量的降低有关，在瘤胃中生长的Succinivibrionaceae可以减少甲烷的排放，因为这一科的一些成员利用氢气来产生琥珀酸盐，而氢气也被产甲烷菌利用来产生丙酸盐[15]。有研究证明，GRS分数高、Prevotellaceae含量高的女性BMI较高，而Prevotellaceae含量低的女性BMI较低[16]。肠道中的Prevotellaceae与肥胖和性别相关。在属水平上，雌雄狍肠道内前3个主要菌属相同，雌性第四大优势菌属为Succinivibrio，雄性第四大优势菌属为Treponema。

有些学者研究表明，野生动物肠道菌群的多样性与其性别有关系。一项针对人体的性别特异性肠道菌群研究报告称，女性组体重指数(BMI)α多样性有差异。但是，男性BMI组之间的α多样性没有显著差异[17]。Zhao等[18]对原麝(Moschusmoschiferus)的研究结果表明不同BMI水平的原麝，性别可能会影响微生物群的组成。这可能是因为在不同的发育阶段，雌性和雄性个体的不同免疫抵抗。有研究表明，免疫系统的性别差异和激素会影响肠道菌群的形成。内分泌系统与微生物组之间的相互作用有助于细菌辅助激素的产生和宿主激素稳态的调节[19]。Chen等[3]对不同性别的猎豹(Acinonyxjubatus))肠道微生物群进行了研究，结果表明猎豹肠道微生物群在性别上不存在显著差异，此结果与本文研究结果圈养狍雌雄肠道菌群结构无显著差异相似。董元秋[20]对不同性别的越冬白头鹤(Grusmonacha)肠道菌群进行了比较研究，其研究结果表明鸟类不同性别肠道菌群组成结构没有显著差异。很多研究表明性类固醇激素与肠道菌群结构有关[21]。

狍是一种反刍动物，其独特的消化特性和微生物群落有助于适应高纤维含量的食物，并在肠道生理和调节中发挥关键作用。但是，圈养狍的健康状况不佳。很多较小养殖场，都陆续倒闭了。据推测，标准合成饲料中不适当的营养物质和高含量的矿物质盐使其易患各种疾病[22]。大量研究表明，肠道微生物稳态的失衡导致肠道和代谢性疾病的发生[12，23]。目前，大量研究表明，狍的饮食、健康状况和基因型对肠道微生物的结构有影响[24-25]。本研究为深入了解狍肠道菌群的多样性提供了新的视角，有利于狍的生理和健康研究，为圈养狍的繁育和圈养动物的野外再引种奠定了基础。