济阴颗粒对高脂血症大鼠胰腺组织TLR-4信号通路的影响

刘小虎,梁茂新，李国信，孟 莉，甘 雨，张 旭，乔菊久，丁春晓，宋 杰，吴 怡，赵 磊

高脂血症为血脂水平过高，可引起动脉粥样硬化、冠心病、胰腺炎等，脂蛋白脂酶缺乏可因乳糜微粒栓子阻塞胰腺的毛细血管，引起局限性胰腺细胞坏死而导致胰腺炎的发生[1]。人体每天摄入过多饱和脂肪酸可引起血胆固醇增高，其中主要以低密度脂蛋白为主[2]。饱和脂肪酸可抑制低密度脂蛋白受体的活性，降低低密度脂蛋白与低密度脂蛋白受体的亲和性。中医认为高脂血症是痰症的一部分，痰湿内阻高脂血症常见于肥胖之人[3]。济阴颗粒是在古代用药规律的基础上结合现代临床经验筛取所得，由生地黄、淫羊藿、丹参、香附、黄柏组成，5味中药皆有调脂作用[4]。本研究分析了济阴颗粒对高脂血症大鼠胰腺组织的影响，旨在为高脂血症引起胰腺损伤的防治及其中药新药研发提供依据。

1 材料与方法

1.1实验药物 济阴颗粒(由生地黄、淫羊藿、香附、丹参和黄柏，按5∶4∶3∶3∶3比例组方而成)。生地黄颗粒(批号：183345)、淫羊藿颗粒(批号：18112331)、丹参颗粒(批号：19032831)、香附颗粒(批号：19051161)、黄柏颗粒(批号：19032251)。上述5种单味药免煎颗粒剂均购于江阴天江药业有限公司。阿托伐他汀钙片(辉瑞制药有限公司，国药准字：J20070060，10 mg/片，批号：X67405)。

1.2主要试剂 兔抗鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)抗体(批号：08012887)、兔抗鼠κ基因结合核因子P65(NF-κB P65)抗体(批号：AE073025)、兔抗鼠Toll-4样受体(toll-likereceptors 4, TLR-4)抗体(批号：04058100)均购于北京博奥森生物技术有限公司。非特异性染色阻断剂(批号：1906205392b)、内源性过氧化物酶阻断剂(批号：190625391h)、生物素标记的羊抗大鼠/兔IgG聚合物(批号：1906215396b)、链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶(批号：1906215395c)、枸橼酸缓冲盐(批号：19032604)、DAB显色试剂盒(批号：1907240031B)均购于福建迈新生物技术开发有限公司。丙硫氧嘧啶(批号：P436521)、吐温-80(批号：P354672)、胆固醇(批号：P354464)、丙二醇(批号：P453641)、胆酸钠(批号：P243652)均购于成都华夏化学试剂有限公司。总甘油三酯(TG)测定试剂盒(双试剂直接法)购于南京建成生物工程研究所；磷酸盐(PBS)缓冲液(批号：20190327)购于北京Solarbio科技有限公司。切片石蜡(批号：20190802)购于上海华东石蜡有限公司。苏木素染液(批号：718112)购于珠海贝索生物技术有限公司。伊红染液(批号：718123)购于珠海贝索生物技术有限公司。中性树胶(批号：20190809)购于中国上海标本模型厂。盐酸-乙醇分化液(批号：190107)购于珠海贝索生物技术有限公司。二甲苯(AR级，批号：20190801)、无水乙醇(AR级，批号：20191017)均购于沈阳市新华试剂厂,乙醚(批号：10009318)购于国药集团化学试剂有限公司。

1.3实验动物 SPF级SD大鼠50只，雌性，体质量160～200 g，购于辽宁长生生物技术股份有限公司;实验动物生产许可证号：SCXK(辽)2015-0001,实验动物使用许可证号：SYXK(辽)2019-0004。大鼠饲养于辽宁中医药大学实验动物中心，饲养条件：温度20～25℃，湿度40%～50%，自由饮食饮水。水及饲料均经辐照消毒处理。

1.4主要实验仪器 MultiskanFC酶标仪(德国Thermo公司)，BX53型光电显微镜(奥林巴斯中国有限公司)，JKDP2型电热恒温培养箱(厦门医疗电子仪器厂)，AUTOSTAINER480S型全自动免疫组化染色机(赛默飞世尔科技有限公司)，TP1020型自动脱水机、EG1150C型冷冻台、切片机、G1150H型包埋机均购于德国Leica公司，YG-280KX型摊片机、YG-280KX型烤片机均购于阳光神琦医用科技有限公司。

1.5实验方法

1.5.1动物造模：所有大鼠均适应性喂养7 d，并按体质量随机分为对照组、模型组、济阴颗粒低剂量组(5.04 g/kg)、济阴颗粒高剂量组(10.08 g/kg)、阿托伐他汀钙组(1.80 mg/kg)，每组10只。除对照组外，其余4组大鼠每天给予脂肪乳剂(胆固醇10 g、猪油25 g、丙硫氧嘧啶1 g、吐温-80 25 ml、1,2-丙二醇20 ml、胆酸钠2 g、蒸馏水30 ml)[5]10 ml/(kg·d)灌胃造模。边造模边给药，对照组和模型组给予蒸馏水10 ml/kg灌胃，其他3组分别给予相应药物10 ml/kg灌胃，连续8周[6]。

1.5.2标本采集和检测方法:5组大鼠末次给药后均禁食、水12 h。乙醚麻醉，大鼠腹主动脉取血分离血清。紫外可见分光光度法检测血清甘油三酯(TG)含量。取出胰腺福尔马林固定，苏木素-伊红(HE)染色观察胰腺组织形态。免疫组化染色检测NF-κB P65、TNF-α、TLR-4。

1.5.3HE染色方法：切片常规梯度脱蜡至水，苏木素溶液染色，1%盐酸乙醇分化，0.5%伊红溶液染色，梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。于400倍显微镜下观察5组大鼠胰腺组织的病理改变，采集图片。

1.5.4免疫组化染色方法：切片常规梯度脱蜡至水。滴加内源性过氧化物酶阻断剂37℃孵育。于枸橼酸钠缓冲溶液(pH 7.0)中高压修复。滴加血清封闭，滴加一抗(TNF-α 1∶200，NF-κB P65 1∶150，TLR-4 1∶200)，孵育。滴加生物素标记的羊抗大鼠/兔IgG聚合物,孵育。滴加链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶,孵育。滴加DAB显色剂。苏木素复染，1%盐酸乙醇分化，中性树胶封片。于400倍显微镜下观察各组大鼠胰腺组织蛋白表达情况，采集图片。图片使用Image J软件进行分析，检测图片中各蛋白表达的灰度值[7]。根据灰度值计算光密度值(OD),OD=log[gv0/gv)]，图片中蛋白表达为阴性区域的灰度值gv0，gv目标区灰度值。

2 结果

2.1大鼠血清TG含量比较 5组TG分别为：对照组(0.64±0.14)mmol/L、模型组(1.72±0.15)mmol/L、济阴颗粒低剂量组(1.37±0.19)mmol/L、济阴颗粒高剂量组(1.24±0.19)mmol/L、阿托伐他汀钙组(1.14±0.17)mmol/L。与对照组比较，模型组血清TG含量显著增加，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，济阴颗粒低、高剂量组和阿托伐他汀钙组血清TG含量显著降低，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。

2.2大鼠胰腺组织病理形态学比较 与对照组比较，模型组大鼠胰腺组织有炎性细胞浸润、水肿，腺泡萎缩，出现类似空泡样结构。与模型组比较，济阴颗粒低、高剂量组和阿托伐他汀钙组胰腺组织病变明显减轻，可见部分腺泡萎缩及少量炎性细胞浸润。见图1。

图1 济阴颗粒对高脂血症模型大鼠胰腺组织的影响(HE×400)济阴颗粒低、高剂量组大鼠分别给予济阴颗粒5.04、10.08 g/kg

2.3大鼠胰腺组织TLR-4、NF-κB P65、TNF-α表达水平比较 与对照组比较，模型组胰腺组织TLR-4、NF-κB P65和TNF-α表达显著增加(P<0.01)。与模型组比较，济阴颗粒低剂量组、高剂量组和阿托伐他汀钙组TLR-4、NF-κB P65和TNF-α表达显著降低(P<0.05，P<0.01)。见表1、图2～4。

图2 济阴颗粒对高脂血症模型大鼠胰腺组织TLR-4表达的结果(HE×400)济阴颗粒低、高剂量组大鼠分别给予济阴颗粒5.04、10.08 g/kg;TLR-4为Toll-4样受体

表1 5组大鼠胰腺组织TLR-4、NF-κB P65和TNF-α表达比较

2.4大鼠血清TG含量与胰腺组织中TLR-4、NF-κB P65及TNF-α表达相关性分析 血清TG含量与胰腺组织TLR-4、NF-κB P65及TNF-α表达具有相关性(r=0.478、0.673、0.727，P<0.01)。

3 讨论

急性胰腺炎为临床中常见的急腹症，病重时可出现全身炎症反应和器官功能障碍，重症急性胰腺炎病死率可高达30%[8]。急性胰腺炎病因主要有胆道疾病、酗酒、高脂饮食等，高脂血症是急性胰腺炎的重要致病因素之一[9]。随着人们饮食结构的改变,目前我国高脂血症性急性胰腺炎发病比例逐年增加。血清TG水平越高，高脂血症性急性胰腺炎发病概率越大，可能与游离脂肪酸的细胞毒作用、炎性介质-细胞因子损伤有关[10]。本研究结果显示，与模型组比较,济阴颗粒低、高剂量组血清TG含量及胰腺组织病变明显减轻。说明济阴颗粒可以通过降低血清TG水平，减轻高脂血症引起胰腺损伤的作用。

图3 济阴颗粒对高脂血症模型大鼠胰腺组织NF-κB P65表达的结果(HE×400)济阴颗粒低、高剂量组大鼠分别给予济阴颗粒5.04、10.08 g/kg;NF-κB P65为κ基因结合核因子P65

图4 济阴颗粒对高脂血症模型大鼠胰腺组织TNF-α表达的结果(HE×400)济阴颗粒低、高剂量组大鼠分别给予济阴颗粒5.04、10.08 g/kg;TNF-α为肿瘤坏死因子-α

Toll样受体为重要病原模式识别受体，可特异性识别病原体相关分子并与之结合，激活免疫炎症反应[11]。TLRs是跨膜模式识别受体，通过受体胞外段的TLR结构域与病原体的“内源性危险信号”相结合；进而激活细胞内信号传导通路，活化NF-κB启动核内相关基因表达，促使IL-6、IL-1β及TNF-α等细胞因子合成与释放，激活免疫细胞并产生炎症反应[12]。

TLR-4分布在人类及大鼠的胰腺管上皮组织和内皮组织中，因此TLR-4触发胰腺炎的炎症反应时存在分子基础。胰腺组织中TLR-4表达增加，提示炎症反应加重[13-14]。急性胰腺炎的早期只有无菌性炎症，TLR-4仍能激活巨噬细胞而释放出大量炎性介质，因此TLR-4在急性胰腺炎的病情变化中起到重要的促炎作用[15]。

NF-κB是一种重要的转录调节因子，参与炎症相关的基因表达；急性胰腺炎进展与TLR-4及其下游信号通路NF-κB密切相关，NF-κB可直接参与调控炎症反应[16]。正常NF-κB以无活性的三聚体形式存在于细胞质中，当细胞受到TNF-α及内毒素等刺激时，NF-κB因与IκB发生解离而激活[17]；NF-κB活化后可使IL-6和TNF-α表达增加，NF-κB通路激活直接增加了胰腺炎的严重程度[18]。

本研究结果显示，济阴颗粒低、高剂量组可显著降低TLR-4、NF-κB P65和TNF-α在高脂血症模型大鼠胰腺组织中的表达，且TLR-4、NF-κB P65和TNF-α在胰腺组织的表达水平与血清中TG含量有相关性。说明济阴颗粒可以通过调节TLR-4信号通路减轻损伤胰腺的作用，与其降低血清中TG含量密切相关。

综上所述，济阴颗粒可通过调节TLR-4信号通路对高脂血症诱导的大鼠胰腺组织损伤产生保护作用，且该作用与济阴颗粒调节高脂血症大鼠血清中TG含量的作用密切相关。