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济阴颗粒对高脂血症大鼠胰腺组织TLR-4信号通路的影响

2021-04-28刘小虎梁茂新李国信乔菊久丁春晓

解放军医药杂志 2021年4期
关键词:高脂血症批号胰腺

刘小虎,梁茂新,李国信,孟 莉,甘 雨,张 旭,乔菊久,丁春晓,宋 杰,吴 怡,赵 磊

高脂血症为血脂水平过高,可引起动脉粥样硬化、冠心病、胰腺炎等,脂蛋白脂酶缺乏可因乳糜微粒栓子阻塞胰腺的毛细血管,引起局限性胰腺细胞坏死而导致胰腺炎的发生[1]。人体每天摄入过多饱和脂肪酸可引起血胆固醇增高,其中主要以低密度脂蛋白为主[2]。饱和脂肪酸可抑制低密度脂蛋白受体的活性,降低低密度脂蛋白与低密度脂蛋白受体的亲和性。中医认为高脂血症是痰症的一部分,痰湿内阻高脂血症常见于肥胖之人[3]。济阴颗粒是在古代用药规律的基础上结合现代临床经验筛取所得,由生地黄、淫羊藿、丹参、香附、黄柏组成,5味中药皆有调脂作用[4]。本研究分析了济阴颗粒对高脂血症大鼠胰腺组织的影响,旨在为高脂血症引起胰腺损伤的防治及其中药新药研发提供依据。

1 材料与方法

1.1实验药物 济阴颗粒(由生地黄、淫羊藿、香附、丹参和黄柏,按5∶4∶3∶3∶3比例组方而成)。生地黄颗粒(批号:183345)、淫羊藿颗粒(批号:18112331)、丹参颗粒(批号:19032831)、香附颗粒(批号:19051161)、黄柏颗粒(批号:19032251)。上述5种单味药免煎颗粒剂均购于江阴天江药业有限公司。阿托伐他汀钙片(辉瑞制药有限公司,国药准字:J20070060,10 mg/片,批号:X67405)。

1.2主要试剂 兔抗鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)抗体(批号:08012887)、兔抗鼠κ基因结合核因子P65(NF-κB P65)抗体(批号:AE073025)、兔抗鼠Toll-4样受体(toll-likereceptors 4, TLR-4)抗体(批号:04058100)均购于北京博奥森生物技术有限公司。非特异性染色阻断剂(批号:1906205392b)、内源性过氧化物酶阻断剂(批号:190625391h)、生物素标记的羊抗大鼠/兔IgG聚合物(批号:1906215396b)、链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶(批号:1906215395c)、枸橼酸缓冲盐(批号:19032604)、DAB显色试剂盒(批号:1907240031B)均购于福建迈新生物技术开发有限公司。丙硫氧嘧啶(批号:P436521)、吐温-80(批号:P354672)、胆固醇(批号:P354464)、丙二醇(批号:P453641)、胆酸钠(批号:P243652)均购于成都华夏化学试剂有限公司。总甘油三酯(TG)测定试剂盒(双试剂直接法)购于南京建成生物工程研究所;磷酸盐(PBS)缓冲液(批号:20190327)购于北京Solarbio科技有限公司。切片石蜡(批号:20190802)购于上海华东石蜡有限公司。苏木素染液(批号:718112)购于珠海贝索生物技术有限公司。伊红染液(批号:718123)购于珠海贝索生物技术有限公司。中性树胶(批号:20190809)购于中国上海标本模型厂。盐酸-乙醇分化液(批号:190107)购于珠海贝索生物技术有限公司。二甲苯(AR级,批号:20190801)、无水乙醇(AR级,批号:20191017)均购于沈阳市新华试剂厂,乙醚(批号:10009318)购于国药集团化学试剂有限公司。

1.3实验动物 SPF级SD大鼠50只,雌性,体质量160~200 g,购于辽宁长生生物技术股份有限公司;实验动物生产许可证号:SCXK(辽)2015-0001,实验动物使用许可证号:SYXK(辽)2019-0004。大鼠饲养于辽宁中医药大学实验动物中心,饲养条件:温度20~25℃,湿度40%~50%,自由饮食饮水。水及饲料均经辐照消毒处理。

1.4主要实验仪器 MultiskanFC酶标仪(德国Thermo公司),BX53型光电显微镜(奥林巴斯中国有限公司),JKDP2型电热恒温培养箱(厦门医疗电子仪器厂),AUTOSTAINER480S型全自动免疫组化染色机(赛默飞世尔科技有限公司),TP1020型自动脱水机、EG1150C型冷冻台、切片机、G1150H型包埋机均购于德国Leica公司,YG-280KX型摊片机、YG-280KX型烤片机均购于阳光神琦医用科技有限公司。

1.5实验方法

1.5.1动物造模:所有大鼠均适应性喂养7 d,并按体质量随机分为对照组、模型组、济阴颗粒低剂量组(5.04 g/kg)、济阴颗粒高剂量组(10.08 g/kg)、阿托伐他汀钙组(1.80 mg/kg),每组10只。除对照组外,其余4组大鼠每天给予脂肪乳剂(胆固醇10 g、猪油25 g、丙硫氧嘧啶1 g、吐温-80 25 ml、1,2-丙二醇20 ml、胆酸钠2 g、蒸馏水30 ml)[5]10 ml/(kg·d)灌胃造模。边造模边给药,对照组和模型组给予蒸馏水10 ml/kg灌胃,其他3组分别给予相应药物10 ml/kg灌胃,连续8周[6]。

1.5.2标本采集和检测方法:5组大鼠末次给药后均禁食、水12 h。乙醚麻醉,大鼠腹主动脉取血分离血清。紫外可见分光光度法检测血清甘油三酯(TG)含量。取出胰腺福尔马林固定,苏木素-伊红(HE)染色观察胰腺组织形态。免疫组化染色检测NF-κB P65、TNF-α、TLR-4。

1.5.3HE染色方法:切片常规梯度脱蜡至水,苏木素溶液染色,1%盐酸乙醇分化,0.5%伊红溶液染色,梯度脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。于400倍显微镜下观察5组大鼠胰腺组织的病理改变,采集图片。

1.5.4免疫组化染色方法:切片常规梯度脱蜡至水。滴加内源性过氧化物酶阻断剂37℃孵育。于枸橼酸钠缓冲溶液(pH 7.0)中高压修复。滴加血清封闭,滴加一抗(TNF-α 1∶200,NF-κB P65 1∶150,TLR-4 1∶200),孵育。滴加生物素标记的羊抗大鼠/兔IgG聚合物,孵育。滴加链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶,孵育。滴加DAB显色剂。苏木素复染,1%盐酸乙醇分化,中性树胶封片。于400倍显微镜下观察各组大鼠胰腺组织蛋白表达情况,采集图片。图片使用Image J软件进行分析,检测图片中各蛋白表达的灰度值[7]。根据灰度值计算光密度值(OD),OD=log[gv0/gv)],图片中蛋白表达为阴性区域的灰度值gv0,gv目标区灰度值。

2 结果

2.1大鼠血清TG含量比较 5组TG分别为:对照组(0.64±0.14)mmol/L、模型组(1.72±0.15)mmol/L、济阴颗粒低剂量组(1.37±0.19)mmol/L、济阴颗粒高剂量组(1.24±0.19)mmol/L、阿托伐他汀钙组(1.14±0.17)mmol/L。与对照组比较,模型组血清TG含量显著增加,差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,济阴颗粒低、高剂量组和阿托伐他汀钙组血清TG含量显著降低,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。

2.2大鼠胰腺组织病理形态学比较 与对照组比较,模型组大鼠胰腺组织有炎性细胞浸润、水肿,腺泡萎缩,出现类似空泡样结构。与模型组比较,济阴颗粒低、高剂量组和阿托伐他汀钙组胰腺组织病变明显减轻,可见部分腺泡萎缩及少量炎性细胞浸润。见图1。

图1 济阴颗粒对高脂血症模型大鼠胰腺组织的影响(HE×400)济阴颗粒低、高剂量组大鼠分别给予济阴颗粒5.04、10.08 g/kg

2.3大鼠胰腺组织TLR-4、NF-κB P65、TNF-α表达水平比较 与对照组比较,模型组胰腺组织TLR-4、NF-κB P65和TNF-α表达显著增加(P<0.01)。与模型组比较,济阴颗粒低剂量组、高剂量组和阿托伐他汀钙组TLR-4、NF-κB P65和TNF-α表达显著降低(P<0.05,P<0.01)。见表1、图2~4。

图2 济阴颗粒对高脂血症模型大鼠胰腺组织TLR-4表达的结果(HE×400)济阴颗粒低、高剂量组大鼠分别给予济阴颗粒5.04、10.08 g/kg;TLR-4为Toll-4样受体

表1 5组大鼠胰腺组织TLR-4、NF-κB P65和TNF-α表达比较

2.4大鼠血清TG含量与胰腺组织中TLR-4、NF-κB P65及TNF-α表达相关性分析 血清TG含量与胰腺组织TLR-4、NF-κB P65及TNF-α表达具有相关性(r=0.478、0.673、0.727,P<0.01)。

3 讨论

急性胰腺炎为临床中常见的急腹症,病重时可出现全身炎症反应和器官功能障碍,重症急性胰腺炎病死率可高达30%[8]。急性胰腺炎病因主要有胆道疾病、酗酒、高脂饮食等,高脂血症是急性胰腺炎的重要致病因素之一[9]。随着人们饮食结构的改变,目前我国高脂血症性急性胰腺炎发病比例逐年增加。血清TG水平越高,高脂血症性急性胰腺炎发病概率越大,可能与游离脂肪酸的细胞毒作用、炎性介质-细胞因子损伤有关[10]。本研究结果显示,与模型组比较,济阴颗粒低、高剂量组血清TG含量及胰腺组织病变明显减轻。说明济阴颗粒可以通过降低血清TG水平,减轻高脂血症引起胰腺损伤的作用。

图3 济阴颗粒对高脂血症模型大鼠胰腺组织NF-κB P65表达的结果(HE×400)济阴颗粒低、高剂量组大鼠分别给予济阴颗粒5.04、10.08 g/kg;NF-κB P65为κ基因结合核因子P65

图4 济阴颗粒对高脂血症模型大鼠胰腺组织TNF-α表达的结果(HE×400)济阴颗粒低、高剂量组大鼠分别给予济阴颗粒5.04、10.08 g/kg;TNF-α为肿瘤坏死因子-α

Toll样受体为重要病原模式识别受体,可特异性识别病原体相关分子并与之结合,激活免疫炎症反应[11]。TLRs是跨膜模式识别受体,通过受体胞外段的TLR结构域与病原体的“内源性危险信号”相结合;进而激活细胞内信号传导通路,活化NF-κB启动核内相关基因表达,促使IL-6、IL-1β及TNF-α等细胞因子合成与释放,激活免疫细胞并产生炎症反应[12]。

TLR-4分布在人类及大鼠的胰腺管上皮组织和内皮组织中,因此TLR-4触发胰腺炎的炎症反应时存在分子基础。胰腺组织中TLR-4表达增加,提示炎症反应加重[13-14]。急性胰腺炎的早期只有无菌性炎症,TLR-4仍能激活巨噬细胞而释放出大量炎性介质,因此TLR-4在急性胰腺炎的病情变化中起到重要的促炎作用[15]。

NF-κB是一种重要的转录调节因子,参与炎症相关的基因表达;急性胰腺炎进展与TLR-4及其下游信号通路NF-κB密切相关,NF-κB可直接参与调控炎症反应[16]。正常NF-κB以无活性的三聚体形式存在于细胞质中,当细胞受到TNF-α及内毒素等刺激时,NF-κB因与IκB发生解离而激活[17];NF-κB活化后可使IL-6和TNF-α表达增加,NF-κB通路激活直接增加了胰腺炎的严重程度[18]。

本研究结果显示,济阴颗粒低、高剂量组可显著降低TLR-4、NF-κB P65和TNF-α在高脂血症模型大鼠胰腺组织中的表达,且TLR-4、NF-κB P65和TNF-α在胰腺组织的表达水平与血清中TG含量有相关性。说明济阴颗粒可以通过调节TLR-4信号通路减轻损伤胰腺的作用,与其降低血清中TG含量密切相关。

综上所述,济阴颗粒可通过调节TLR-4信号通路对高脂血症诱导的大鼠胰腺组织损伤产生保护作用,且该作用与济阴颗粒调节高脂血症大鼠血清中TG含量的作用密切相关。

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