eIF5A-2下调对人肺癌细胞株A549/DDP耐药及自噬的影响*

李星 刘东升 杜钢

(巴彦淖尔市医院放疗科，内蒙古 巴彦淖尔 015000)

肺癌是最常见的一种恶性肿瘤，男性发病率较高，是导致癌症死亡的主要原因之一[1-2]。随着肺癌发病率日益升高，其已经从一种罕见的疾病转变为全球性公共卫生问题[3-4]。肺癌主要分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌[5]，其治疗主要是通过手术、放疗、化疗，其中以顺铂为代表的铂类抗肿瘤药是治疗非小细胞肺癌的一线化疗药[6-7]，顺铂可引起肿瘤细胞DNA损伤从而介导多种细胞信号通路抑制细胞增殖、促进细胞凋亡[8]。但顺铂的耐药现象逐渐加剧[9]，给临床治疗带来困难。目前对顺铂耐药的机制尚不明确。因此，探讨顺铂耐药的机制对肺癌的治疗具有重要影响。近年研究发现，真核翻译起始因子5A-2(Eukaryotic Translation Initiation Factor 5A-2，eIF5A-2)与肿瘤的发生、发展有关，在肿瘤细胞内eIF5A-2高表达并可促进肿瘤细胞的增殖、凋亡等过程[10]，但eIF5A-2对肺癌细胞耐药性的影响鲜有报道。本研究采用小干扰RNA(Small Intemring RNA，siRNA)转染人肺癌A549/DDP细胞，探讨抑制eIF5A2对A549/DDP细胞耐药性的影响并分析其可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂 人肺癌细胞株A549/DDP(货号ZQ0461)购自上海中乔新舟生物科技有限公司；引物、eIF5A-2-siRNA慢病毒均由上海吉凯基因生物公司设计合成；实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)试剂盒(货号14966005)均购自美国ThermoFisher公司；反转录试剂盒(货号K1622)购自美国Fermentas公司；Trizol(货号46301)购自美国Sigma公司；兔抗人单克隆eIF5A2抗体(货号ab150439)、兔抗人多克隆LC3 Ⅱ抗体(货号ab51520)、兔抗人单克隆Beclin-1抗体(货号ab207612)购自美国Abcam公司。

1.2 仪器 酶标仪(型号SpectraMax iD3)购自上海美谷分子仪器有限公司；电泳仪(型号1658001)购自美国Bio-Rad公司；实时荧光定量PCR仪(型号ABI9700)购自美国ABI公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养 人肺癌A549和A549/DDP细胞接种于RPMI-1640完全培养基(含1%双抗，10% FBS)，置于37 ℃，0.5%的CO2孵育箱中培养，待细胞融合至80%时，弃培养基，加入含500 ng/mL DDP药物的培养液，放入培养箱，2～3 d换液，待细胞长满消化传代，进入对数生长期时收集细胞进行后续实验。

1.3.2 慢病毒转染及细胞分组 取1.3.1细胞接种于以2×105个/孔接种于24孔板，细胞融合至60%时转染，按照慢病毒转染说明书操作，实验分为4组：正常对照组(人肺癌细胞A549)，空白对照组(人肺癌细胞A549/DDP)：不采用病毒转染，阴性对照(Negative Control，NC)组：采用LV-NC-GFP转染A549/DDP细胞，eIF5A-2 SiRNA(SiRNA)组：采用LV-eIF5A-2-SiRNA-GFP转染A549/DDP细胞。转染6 h后更换新鲜培养基，培养48 h后，置于荧光显微镜下观察转染效率。培养72 h后，收集细胞，进行后续实验。

1.3.3 qRT-PCR检测各组细胞eIF5A-2 mRNA相对表达水平 Trizol提取1.3.2中各组细胞总RNA，按照反转录试剂盒说明书对RNA合成cDNA，按照实时荧光定量PCR试剂盒说明书配制反应体系，反应条件95 ℃预变性15 min、95 ℃变性10 s、56 ℃退火20 s、72 ℃延伸50 s，40个循环，以GAPDH为对照，采用2-△△Ct法分析eIF5A-2 mRNA相对表达水平。引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.4 MTT检测DDP作用下A549/DDP细胞的耐药性 1.3.2中细胞以2×104个/孔接种于96孔板24 h后加入终浓度为8 μg/mL DDP，每组设8个复孔，设置调零孔，继续培养48 h，每孔加入20 μL浓度5 mg/mL的MTT溶液，培养4 h后，弃上清，每孔加入150 μL DMSO放于摇床震荡10 min，待结晶完全溶解后在酶标仪检测570 nm处各孔的OD值。计算各组细胞半数抑制浓度(IC50)。

1.3.5 流式细胞术检测A549/DDP细胞凋亡率 细胞转染72 h后，每组加入终浓度为8 μg/mL DDP，48 h后收集细胞，按照Annex-in V-FITC凋亡试剂盒方法在流式细胞仪上检测每组细胞的凋亡率。

1.3.6 单酰戊二胺(MDC)染色检测细胞中自噬小体形成情况 1.3.2中细胞转染72 h，常规消化离心，收集各组细胞用1×清洗缓冲液清洗细胞弃上清，重悬细胞并调整每组细胞至1×106个/mL。取细胞悬液加至新EP管中，加入MDC染液，轻轻混匀，避光孵育30～40 min，用1×冲洗缓冲液清洗细胞2～3次，弃上清，收集细胞，加入抗荧光淬灭封片剂，荧光显微镜下观察细胞中自噬小体的形成，统计自噬小体的数目。

1.3.7 Western blot法检测eIF5A-2、LC3Ⅱ及Beclin-1蛋白相对表达水平 收集1.3.2各组细胞，用含PMSF的RIPA裂解液冰水浴下裂解，提取蛋白，BCA法蛋白定量，按照4∶1在蛋白中加5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，沸水浴加热3～5 min，置于-20 ℃保存。按照SDS-PAGE凝胶配方表制备12%分离胶和5%浓缩胶，以每泳道30 μg蛋白上样，蛋白凝胶电泳，根据蛋白marker切胶，湿法转膜，抗体LC3Ⅱ、Beclin-1、eIF5A-2均按照1∶1000的比例稀释后与PVDF膜4 ℃孵育过夜，TBST清洗，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，室温孵育并放摇床2 h，TBST清洗，参考ECL发光液说明书对条带孵育、曝光、显影。通过Image J软件对条带灰度值分析。

2 结果

2.1 各组细胞eIF5A-2 mRNA表达水平 与正常对照组相比，空白对照组、NC组细胞中eIF5A-2 mRNA相对表达水平显著升高(P<0.05)；与空白对照组、NC组相比，eIF5A-2 SiRNA组细胞eIF5A-2 mRNA相对表达水平显著降低(P<0.05)，见图1。

图1 各组细胞中eIF5A-2 mRNA相对表达水平

2.2 eIF5A-2下调对A549/DDP细胞的耐药性影响 与正常对照组相比，空白对照组、NC组细胞半数抑制浓度IC50显著升高(P<0.05)；与空白对照组、NC组相比，eIF5A-2-SiRNA组细胞半数抑制浓度IC50显著降低(P<0.05)，见图2。

2.3 eIF5A-2下调对DDP作用下A549/DDP细胞的凋亡的影响 与空白对照组、NC组细胞相比，eIF5A-2-SiRNA组细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，见图3～4。

图2 各组细胞DDP耐药性

图3 各组A549/DDP细胞凋亡情况

图4 各组A549/DDP细胞凋亡率

2.4 eIF5A-2下调对A549/DDP细胞自噬水平的影响 与空白对照组、NC组细胞相比，eIF5A-2-SiRNA组细胞中自噬小体数目显著减少(P<0.05)，见图5～6。

2.5 eIF5A-2下调对A549/DDP细胞中eIF5A-2、LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表达的影响 与空白对照组、NC组细胞相比，eIF5A-2-SiRNA组细胞eIF5A-2、LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白相对表达水平显著降低(均P<0.05)，见图7～8。

图5 各组细胞中自噬小体形成情况(200×)

图6 各组A549/DDP细胞中自噬小体数目

图7 Western blot检测各组A549/DDP细胞中eIF5A-2、LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表达

图8 各组A549/DDP细胞eIF5A-2、LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白相对表达水平

3 讨论

eIF5A2基因位于人类染色体3q26.2区[11]，其编码的蛋白在真核生物组织和细胞中大量存在，可促进蛋白质的合成，在翻译蛋白质过程发挥起始和延伸作用。大量研究表明，eIF5A2蛋白在正常组织细胞中低表达，在多种恶性肿瘤细胞中高表达，在肿瘤的发生发展过程中可能作为致癌因子发挥作用[12-13]。

肺癌的发病率高，预后差，对化疗顺铂的耐药性日益升高已经成为临床治疗的难题，探讨肺癌细胞对顺铂的耐药性机制具有极其重要的科学意义[14-15]。因此，本研究以人肺癌A549/DDP细胞株为研究对象检测发现，与正常对照组A549细胞相比，空白组、NC组A549/DDP细胞中elF5A2 mRNA相对表达水平明显升高，提示elF5A2在人肺癌A549/DDP细胞中高表达。近年研究发现，elF5A2抑制剂GC7与西妥昔单抗联用可明显提高上皮性肝癌细胞对西妥昔单抗的敏感性，提示GC7可能通过抑制elF5A2表达，促进西妥昔单抗对肝癌细胞毒性[16]。Liu等[17]研究表明，RNA干扰沉默eIF5A-2可提高急性髓细胞白血病细胞对柔红霉素的敏感性。此外，研究发现敲除eIF5A2基因可逆转上皮间质转化过程，调节胃癌细胞对DDP的敏感性[18]。本研究通过转染eIF5A-2 SiRNA沉默elF5A2表达，结果发现，与空白组、NC组相比，eIF5A-2-SiRNA组A549/DDP细胞eIF5A-2 mRNA及蛋白相对表达水平显著降低，提示elF5A2低表达模型建立成功。进一步用不同浓度的DDP干预耐药A549/DDP细胞，研究发现，与空白对照组、NC组相比，eIF5A-2-SiRNA组半数抑制浓度IC50显著降低，细胞凋亡率显著升高，提示elF5A2下调可提高人肺癌A549/DDP细胞对DDP的敏感性，促进细胞凋亡。

自噬是细胞处于营养缺乏或外界刺激状态下产生的一种自身保护机制，有助于细胞存活，细胞可通过自噬作用降解未折叠蛋白质和受损细胞器，消化清除细胞内垃圾，维持细胞内代谢平衡[19-20]。此外，自噬参与肿瘤发生发展、新陈代谢紊乱、神经退行性变等病理过程，细胞自噬与肿瘤细胞的耐药密切相关[21]。Xiao等[22]研究发现，抑制热休克蛋白HSP90AA1可抑制骨肉瘤细胞的自噬保护作用，增加细胞对耐阿霉素、顺铂和甲氨蝶呤药等化疗药物的耐药性。TXNDC17过表达可通过促进卵巢癌细胞自噬，从而促进细胞对紫杉醇产生耐药性[23]。本研究发现，与空白对照组、NC组细胞相比，eIF5A-2-SiRNA组A549/DDP细胞中自噬小体数目显著减少，提示下调elF5A2表达可降低人肺癌A549/DDP细胞的自噬水平。自噬微管相关蛋白LC3Ⅱ和Beclin-1在自噬体形成中起重要作用，LC3Ⅱ位于前自噬泡和自噬泡膜表面，是自噬体形成的重要蛋白，LC3Ⅱ可与p62结合形成多聚泛素化蛋白-p62复合物，泛素化蛋白被解降，是检测自噬活性的标志蛋白之一[24]。Beclin-1作为启动自噬过程的关键蛋白，可正向调节自噬过程[25-26]。本研究发现，与空白对照组、NC组细胞相比，eIF5A-2-SiRNA组A549/DDP细胞中LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白相对表达水平均显著降低，提示下调elF5A2表达可降低A549/DDP细胞中LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表达。

4 结论

elF5A2下调可降低人肺癌细胞株A549/DDP耐药性，可能与下调LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表达，降低细胞的自噬水平有关。elF5A2可能成为逆转肺癌化疗耐药的一个新靶点，为临床治疗肺癌对顺铂的耐药性提供参考据。而本研究还存在一定的局限性，未对elF5A2下调抑制自噬的具体机制进行分析，存在不足，后期将进一步研究。