大豆籽粒脂肪酸组分气相色谱检测方法的建立

昝光敏，张 玲，张延瑞，盛英华，周 凯，王贤智

（云南大学农学院，昆明650091）

0 引言

大豆[Glycine max(L.)Merr.]是世界上重要的油料作物之一，其产量约占世界油料作物产量的60%[1]。大豆籽粒中含有丰富的营养成分，其中蛋白质含量约40%，脂肪含量约18%～22%[2]。大豆油脂主要由5种脂肪酸组成，分别为棕榈酸(16:0)、硬脂酸(18:0)、油酸(18:1)、亚油酸(18:2)和亚麻酸(18:3)，其中棕榈酸和硬脂酸为饱和脂肪酸，油酸、亚油酸和亚麻酸为不饱和脂肪酸。饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的组分和比例决定了大豆油的品质及用途。富含不饱和脂肪酸的大豆油主要用作食用植物油，其不饱和脂肪酸除了可以满足人体营养之必需外，还可以起到降低胆固醇的作用，对高血压及心脑血管疾病也有辅助治疗作用[3]。富含饱和脂肪酸的大豆油主要适用于加工制造人造黄油和起酥油，以及广泛用于工业制造润滑油、油墨和生物柴油等[4-5]。

大豆籽粒中脂肪酸的提取主要有索氏抽提法、超临界CO2萃取法与甲酯化提取法[6]。其中索式提取法作为一种国家标准测定方法，虽然精确性高，但操作繁琐、耗时长且费用高昂[7]。超临界CO2萃取法提取脂肪酸油脂得率较索氏法高，分离鉴定出的物质也相对较多，所需时间相对较短[8]。甲酯化提取法因其操作简单，提取率相对较高而被较广应用[9-10]。

大豆籽粒脂肪酸检测方法较多，如气相色谱法(Gas Chromatography,GC)[11-12]、高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)[13-14]和近红外光谱分析法(Near Infrared Reflectance Spectroscopy,NIRS)[15-17]等，其中气相色谱法定量检测大豆籽粒脂肪酸应用最为广泛[9]。气相色谱法检测脂肪酸含量的原理是利用不同脂肪酸的熔点与在色谱柱固定相中保留的时间的相关性，而将不同脂肪酸分离，并根据各组分的出峰时间及峰面积定性定量检测脂肪酸[10]。已有多位学者对气相色谱检测脂肪酸方法优化进行了大量研究。唐芳等[18]对山茶油脂肪酸进行甲酯化，并分析甲酯化振摇温度以及振摇时间，结果表明：甲酯率随振摇温度增加而不断增高，温度为70℃时甲酯化程度最好，当温度超过70℃时，甲酯化副反应程度加强；同时甲酯化率随振摇时间增加而不断增高，振摇60 min时甲酯化率最好。于福宽等[6]采用传统索氏抽提法、改良籽粒直接甲酯化法和豆粉直接甲酯化法3种方法处理样品进行比较研究，同时选用气相色谱技术分析大豆5种脂肪酸组分含量，结果表明：传统索氏抽提法适合样品量大的研究，检测精度较高，但较费工费时；豆粉直接甲酯化法适合大量样品的快速检测，可以避免长时间加热对脂肪酸组分的影响，检测结果相对准确；籽粒直接甲酯化法简单快捷，但仅适用于样品量较少的研究。张凤枰等[19]建立气相色谱内标法测定水产饲料中脂肪酸含量，测定结果重现性好，可信度高，可简化脂肪酸检测周期长，但存在操作步骤繁琐等问题。

目前，虽然已有多位学者对大豆脂肪酸含量检测的气相色谱法检测方法进行了研究，但都存在甲酯化时间较长、使用试剂较多、色谱条件较复杂等问题[20-21]。因此，本研究采用甲酯化处理方法对大豆5种脂肪酸进行提取，并对提取条件进行优化；通过优化气相色谱检测条件，建立基于内标法和外标法的大豆脂肪酸快速、高效的气相色谱检测方法，研究结果对大豆脂肪酸含量的快速准确测定及食品检测等具有一定的指导意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

来自不同地区的16份大豆种子（表3）。试验于2018年12月—2019年11月在云南大学农学院分子育种实验室进行。

1.2 实验标准品与分析仪器

标准品：5种脂肪酸标准品，即棕榈酸，硬脂酸，油酸，亚油酸和亚麻酸，十七碳酸甘油三酯(Triheptadecanoin)标准品及5种脂肪酸甲酯标准品，均购于武汉美泰克科技有限公司。

分析仪器：气相色谱仪(Thermo Fisher TRACE 1310)；自动进样器(Thermo Fisher AI-AS 1310)；色谱柱Thermo Fisher RT-Wax(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。

1.3 大豆籽粒脂肪酸甲酯化提取的优化

取30.0 mg大豆粉放入2 mL离心管中，加入1 mL甲醇钠，水浴加热间隔摇匀。之后加入1 mL正己烷，2000 r/min离心5 min，取上清液放置于色谱专用样品瓶中，进行气相色谱检测。

水浴加热设置不同的处理温度和处理时间，分别为：甲酯化温度设置40℃、45℃、50℃、55℃和60℃五个梯度；甲酯化时间设置20 min、25 min、30 min、35 min和40 min五个梯度。

1.4 气相色谱检测条件优化

进样量：1 μL；分流进样方式：分流比25：1，恒流2 mL/min；吹扫流量5 mL/min；进样口温度：250℃；检测器：火焰离子检测器(FID)，温度为250℃；载气：氮气40 mL/min，氢气35 mL/min，空气350 mL/min。

程序升温方式：以90℃为起始温度，以20℃/min的速率升温至160℃，保持1 min；以2℃/min的速率升温至220℃，保持2 min。

1.5 外标法的建立（大豆脂肪酸标准曲线的绘制）

称取脂肪酸甲酯标准品10.0 mg放入色谱专用瓶中，用移液枪吸取1 mL正己烷与标准品混合。再从样品瓶中吸取500 μL溶液放入另一个色谱样品瓶中，混合均匀，后面的步骤依此类推，用半倍稀释法对标准品进行稀释，共设置5个浓度梯度配制（表1）。标准溶液配好后，采用气相色谱仪对其进行分析，以标准溶液浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

表1 5个浓度梯度混合标准品的配制

1.6 内标法的建立（脂肪酸标准品的甲酯化）

按步骤1.3的方法进行甲酯化，加完甲醇钠后加入150 μL的内标物（十七碳酸甘油三酯）。

1.7 内标法与外标法的比较

分别用内标法和外标法检测同一大豆样品的5种脂肪酸含量的百分比，并对2组数据进行相关性研究。

2 结果与分析

2.1 甲酯化温度优化

对不同甲酯化温度下的大豆脂肪酸峰面积进行分析表明：甲酯化温度在40～60℃时，除了油酸和亚油酸外其他脂肪酸的含量变化差异较小；其中50℃时油酸和亚油酸的含量最高（图1）。因此，50℃是大豆脂肪酸比较理想的甲酯化温度。

图1 不同甲酯化温度对大豆脂肪酸含量的影响

2.2 甲酯化时间优化

对不同甲酯化时间下的大豆脂肪酸峰面积进行分析表明：大豆脂肪酸的甲酯化时间在20～40 min时，亚油酸对温度变化较敏感，其他脂肪酸组分随着时间的变化其含量变化差异较小；当甲酯化时间为35 min时，5种大豆脂肪酸含量均最高（图2）。因此，35 min是大豆脂肪酸甲酯化的最佳时间。

图2 不同甲酯化时间对大豆脂肪酸含量的影响

2.3 大豆5种脂肪酸的定性分析

将5种大豆脂肪酸标准品甲酯化后上样检测，确定其出峰时间，结果表明：棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸和内标物(TAG-C17)的出峰时间分别为17.18 min、23.95 min、24.72 min、26.40 min、28.76 min和20.44 min（图3）。十七碳酸甘油三酯的出峰时间与5种脂肪酸的出峰时间相近且互不干扰，所以十七碳酸甘油三酯是较理想的内标物。

图3 5种大豆脂肪酸的定性分析

2.4 大豆5种脂肪酸标准曲线

将5个浓度梯度的脂肪酸甲酯标准品混合后，采用气相色谱仪检测并绘制标准曲线，结果表明：棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸在其浓度范围内均表现出良好的线性关系（图4），其中亚麻酸在0.4～0.7 mg表现出良好的线性关系，各脂肪酸组分的判定系数均大于0.98727（表2）。

图4 5种大豆脂肪酸含量的标准曲线

表2 5种大豆脂肪酸标准曲线相关系数

2.5 内标法与外标法的比较

分别选用内标法(M1)与外标法(M2)检测16个大豆品种的5种脂肪酸组分含量，然后计算出两组数据的相关系数，结果表明：内标法和外标法检测结果几乎一致（表3）。因此本研究建立的内标法与外标法均适于大豆各脂肪酸组分的定量检测。

表3 两种检测方法所测脂肪酸含量结果比较

续表3

3 讨论与结论

3.1 大豆脂肪酸甲酯化提取的优化

由于脂肪酸的沸点较高，高温下不稳定且容易裂解，分析中容易造成损失。因此对脂肪酸进行甲酯化可以降低沸点，从而提高其稳定性[22]。脂肪酸的甲酯化过程中，处理时间和温度等因素均会对甲酯化结果产生影响[23-24]。张征等[23]对植物油脂肪酸组分在不同酸催化甲酯化反应的回流时间、回流温度的影响进行研究，结果表明：当回流温度为75℃且回流时间为60 min时，脂肪酸的甲酯化反应效果最佳。范胜栩等[25]对改良加热甲酯化提取法和简易甲酯化提取法进行对比分析，发现前者脂肪酸提取率更高，但因缺少对不同甲酯化温度和时间的比较，无法确定大豆脂肪酸的提取条件是否是最优的。牛红红等[26]探究了甲酯化温度和时间对5种脂肪酸含量的影响，但温度与时间的梯度范围过大，得到的结果不够准确。本研究对样品的前处理过程进行了部分优化和简化，优化过程为：用30 mg的大豆粉，加入1 mL的甲酯钠，50℃下甲酯化35 min，之后加入1 mL正己烷萃取一次。与范胜栩等[25]研究相比，本研究在加热甲酯化提取法的基础上设置了不同甲酯化温度和时间梯度，得出了最优大豆脂肪酸甲酯化提取温度和时间条件，降低了甲酯化处理的温度，减少了脂肪酸分析中的损失。与牛红红等[26]研究相比，本研究省去了一次正己烷萃取和加无水硫酸钠等过程，试剂使用量减少，因此节约大量时间与成本，减少对环境的污染，进而样品被甲酯化后稳定性好。同时在绘制5种大豆脂肪酸标准曲线之前，直接对脂肪酸甲酯样品上样检测，省去对样品甲酯化的繁琐过程，从而可以减小甲酯化过程带来的误差，使标准曲线更加准确。

3.2 气相色谱检测条件优化

目前气相色谱检测脂肪酸含量的仪器平台主要有HP 6890 气相色谱仪[27]、890 气相色谱仪[28]、Auto System XL气相色谱仪[29]和Agilent 6890气相色谱仪[12]等，均存在一定的局限性，如HP 6890气相色谱仪在使用的过程中，所需试剂较多，耗时长，操作复杂等。本研究使用的分析仪器为赛默飞气相色谱仪(Thermo Fisher TRACE 1310)，其样品和标准品可根据程序要求自动进样，从而缩短了样品制备所需的时间，提高了结果的准确性，降低人为因素造成的误差。与苗兴芬等[12]研究相比，本研究的检测器温度降低25℃，氮气和氢气各降低5 mL/min，空气降低100 mL/min，程序升温仅需保持3 min，减少了相应的分析时间。虽然本研究对基于赛默飞气相色谱仪(Thermo Fisher TRACE 1310)检测平台气相色谱条件进行了初步摸索，但是未对进样温度、检测温度、进气量等条件进行深入研究，因此在今后的研究中有待进一步的摸索。

3.3 内标法的建立

采用气相色谱定量分析不同植物的脂肪酸含量有不同的方法，目前主要有归一法、内标法和外标法等[30]。徐伟东等[27]使用HP6890气相色谱仪对大豆脂肪酸含量进行检测，选用十一酸甲酯加叔丁基甲醚制成内标物，比较内标法与归一法的检测结果，结果表明：内标法与归一法测定的结果基本一致。罗玥等[31]通过比较气相色谱内标法和外标法测定酒中甲醇的检测结果，结果表明：两种方法的测定结果没有明显差异，但由于内标法可以消除操作等原因引起的干扰而提高分析结果的准确性。张凤枰等[32]在测定核桃油中的脂肪酸时，建立了以十七烷酸甲酯为内标物的毛细管气相色谱内标法，结果表明：内标法检测脂肪酸组分定量准确且重现性好。本研究使用的仪器为赛默飞气相色谱仪(Thermo Fisher TRACE 1310)，因5种脂肪酸组分在气相分析时的出峰时间均较长，因此选用十七烷酸甘油三酯作为内标物，结果表明：内标物的出峰时间与待测物相近且互不影响，分离效果良好。同时本研究结果表明，大豆脂肪酸气相色谱检测的内标法和外标法检测结果几乎一致，可表明两种检测方法均适用于大豆各脂肪酸组分的定量检测。

综上所述：本研究对大豆脂肪酸甲酯化提取方法进行了优化，最优的甲酯化温度为50℃，最优处理时间为35 min。优化后的甲酯化提取方法节约了时间和试剂使用量，同时减少了脂肪酸的损失，分析结果更为稳定准确。本研究同时优化了基于赛默飞气相色谱仪(Thermo Fisher TRACE 1310)检测平台的检测条件，缩短了分析时间和检测气体的使用量，并建立了大豆脂肪酸的内标法和外标法检测方法，明确了内标法和外标法均适用于大豆脂肪酸组分含量的检测，而内标法更方便快捷且成本较低。