金花葵染色体倍性分析及属间远缘杂交研究

尹 国，路正营，孙 璐，张彦波，李世云

（邯郸市农业科学院，河北邯郸056001）

0 引言

陆地棉，属锦葵科、棉属一年生草本植物，是一种国家重要战略物资。棉铃虫曾在中国各大棉区大面积发生，转Bt抗虫棉的种植，已基本控制了棉铃虫的发生。然而，蚜虫和红蜘蛛等次生害虫逐渐成为危害棉花生长的主要害虫，严重影响棉花产量和品质[1]。目前生产上主要依靠农药控制蚜虫和红蜘蛛，一方面增加了植棉成本，另一方面容易造成环境污染。因此，培育抗蚜虫和红蜘蛛的棉花新品种，利用作物自身的抗性防治蚜虫和红蜘蛛成为育种家急需攻克的一个难题。

金花葵(Abelmoschus manihot)，又名菜芙蓉、野芙蓉，是属锦葵科、秋葵属的一年生草本植物，和棉花一样具有无限开花结果习性。其对蚜虫和红蜘蛛具有一定程度上天然的抗性，可在叶柄和叶背面分泌一种盐晶状颗粒物，但其对棉铃虫不具有抗性。二者同属锦葵科作物，亲缘关系较近，具有相似的花器官和结构。相较于陆地棉，金花葵的果实较为早熟。前人从不同方面，例如远缘杂交的方法、幼胚拯救、杂交种农艺性状变异、果实成分变化、杂交种纯度和真实性等方面对远缘杂交进行了深入的研究，获得了大量数据，利用远缘杂交创制新的种质资源并获得成功的案例已有大量报道，徐凤等[2]研究了22常绿杜鹃远缘杂交种子萌发特性，证实虽然杜鹃花属种间杂交可以获得种子，但是很多组合产生的种子不具有活力。郑本川等[3]的研究结果显示远缘杂交后代单株产量和农艺性状与亲本存在较大差异。刘国彬等[4]板栗和锥栗之间可以进行远缘杂交，并获得了结实率较高的组合。杨利平等[5]对百合科作物进行了远缘杂交并对杂交种的纯度进行了鉴定。王学芳等[6]利用甘蓝型油菜与白菜，通过种间杂交创造出了早熟油菜新种质。但是，目前关于金花葵的研究成果相对较少，其染色体倍性和条数以及以金花葵和陆地棉为亲本的远缘杂交未见相关报道，对其遗传特性和亲和力知之甚少。因此，本研究利用远缘杂交技术将金花葵gDNA导入陆地棉，希望在其后代中找到有价值的符合育种目标性状的种质资源，这一研究也是培育抗蚜虫和红蜘蛛的早熟陆地棉新品种的有益尝试。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料‘金花葵3号’和陆地棉种子‘邯818’，均为邯郸市农业科学院自育品种。如图1所示两种植物主要不同器官之间的差异。

图1 ‘金花葵3号’和‘邯818’主要器官差异

1.2 方法

1.2.1 ‘金花葵3号’根尖染色体压片镜检 利用沙培法培养‘金花葵3号’，当根尖长至1～1.5 cm时剪取根尖进行试验，采用任文娟[7]、李心[8]、丁海燕[9]和李晓玲等[10]提供的方法压片镜检，用0.002 mol/L 8-羟基喹啉及4℃低温处理根尖[11]，预处理5 h。卡诺固定液固定24 h并利用蒸馏水充分清洗后，用1 mol/L HCl 60℃解离6～10 min，改良的卡宝品红染液染色，压片镜检[12]。挑选染色体形态完整、分散性较好的中期压片拍照[13]。

1.2.2 远缘杂交

（1）培育幼苗，用500 mg/L浓度的缩节胺溶液分别处理金‘花葵3号’和‘邯818’各18 h。采用常规沙培法培育幼苗，‘邯818’于4月18日播种，‘金花葵3号’于4月30日播种，二者错期播种育苗，以利于二者于7月中上旬实现花期相遇。设置温度为30℃，光照和黑暗环境培养各12 h，直至幼苗长出。

（2）幼苗长出后，待幼苗长至3 cm高时，喷洒300 mg/L浓度的缩节胺2～3次，对幼苗进行化控，防止出现高脚苗，促进幼苗主茎变粗壮，为接下来二者的嫁接做好准备。

（3）待二者的主茎达到2.5～3.0 mm时，以陆地棉幼苗为砧木，以金花葵幼苗为接穗将二者进行嫁接，促进两种作物营养物质和遗传物质的交流，提高二者开花期做杂交时的亲和性。同时，留下部分‘金花葵3号’和‘邯818’幼苗自然生长。

（4）待嫁接苗完全成活后，转移至室内靠近窗户的地方，在通风弱光的环境中进行炼苗，3～5天后待嫁接苗足够强壮时，将嫁接苗一分为二，移栽至编号为Z和z的两个防虫网大棚中；同样，将‘邯818’一分为二，移栽至编号为M和m的两个防虫网大棚中，‘金花葵3号’幼苗移栽至编号为J的防虫网大棚中，防止开花期做杂交时蜜蜂和昆虫传粉，形成假杂交铃。

（5）待嫁接苗和‘邯818’均开花时，于每天下午17:00—19:00时之间，将当天Z和M棚中的嫁接苗和‘邯818’的花蕾全部剥开去雄，记录去雄数量。用手将花冠从基部撕下，保留花萼，用刀片将花丝和花药全部从花柱上自上而下轻轻刮下，不要损伤花柱和柱头。将吊牌悬挂于去雄花蕾花柄的基部并记录去雄日期。仔细检查每一棵嫁接苗，确保无遗漏花蕾（如图2所示）。

图2 ‘金花葵3号’去雄后的花蕾

（6）于第二天上午10时左右，待z、m棚的嫁接苗和‘邯818’花粉散开后，取下花朵，撕下花冠和花萼，分别将z棚中嫁接苗的花粉均匀涂抹M棚中‘邯818’已去雄的柱头上；同理，将m棚中邯818的花粉均匀涂抹Z棚中嫁接苗已去雄的柱头上，然后将配制的用于提高远缘杂交结实率的营养液（见表1）用微型注射器在雌蕊的基部各注射3个点，每个点5～8 μL，同时设置对照。将嫁接苗和‘邯818’的花冠用剪刀剪成2 cm×2 cm大小的方块，分别将‘邯818’和嫁接苗的花粉均匀涂抹于方块上，最后用此方块将嫁接苗和‘邯818’的柱头包裹，用红绳连同柱头、涂抹方块和花萼一起捆扎（如图3所示），避免离体花粉直接暴露在太阳紫外线中而过早失去活力。连续去雄和授粉10～15天，确保去雄和授粉杂交铃数量在200个以上。

表1 提高远缘杂交结实率营养液成分含量表(1 L)

图3 远缘杂交授粉后苞叶柱头捆扎方法

（7）每日记录杂交铃的生长发育情况，包括正常发育和脱落杂交铃的数量等相关信息。

1.2.3 种子收集 约35天后，待嫁接苗杂交铃由绿色变为黑色即将炸裂前，将每个杂交铃连同吊牌一起单独装入一个网沙袋中，放置太阳光下晾晒直至杂交铃自然开裂，将外壳去除，收集杂交铃种子待用。

1.2.4 发芽率检测将嫁接苗上得到的杂交种，‘金花葵3号’和‘邯818’种子各50粒，单粒播种在育苗盘中，放置光照培养箱中，设置温度为30℃，光照和黑暗环境各12 h，记录杂交种子出苗日期和发芽率。

1.2.5 杂交种真实性SSR扩增检测 待杂交种、‘金花葵3号’和‘邯818’长出真叶后，利用宋国立等[14]、叶磊等[15]、和王沛政等[16]提供的DNA提取方法，同时提取‘金花葵3号’、‘邯818’以及杂交种的嫩叶的gDNA，利用SSR分子标记技术[17-19]筛选出‘金花葵3号’和‘邯818’特异性引物J-3和H818，引物序列见表2。

表2 引物名称及序列

1.2.6 杂交种根尖染色体压片镜检 方法同1.2.4。

2 结果与分析

2.1 ‘金花葵3号’及杂交种根尖染色体压片镜检

通过‘金花葵3号’根尖镜检结果得知，‘金花葵3号’含有66条染色体，核型公式为K(2n)=2x=66，由此可知‘金花葵3号’为二倍体植物，其花粉和母细胞应含有33条染色体。‘邯818’为含有52条染色体的异源四倍体陆地棉品种，其花粉含有26条染色体。因此二者的杂交种F1（‘金花葵3号’为母本）应为含有59条染色体的异源三倍体，根尖镜检结果进一步证实了该结论（图4）。由于该杂交种为异源三倍体，因此无法完成有丝分裂，杂交种F1发芽试验完成后继续培养幼苗，花粉全部败育，并未得到F2。

图4 ‘金花葵3号’和杂交种F1根尖染色体镜检结果

2.2 不同授粉处理方法成铃率比较

由表3可知，以陆地棉‘邯818’为母本的杂交组合，无论是直接杂交还是注射营养液，均未得到正常发育的杂交铃，幼铃一般在授粉后2～5天即脱落。而以‘金花葵3号’为母本的杂交组合，直接授粉杂交后的207个杂交铃，虽然得到了7个正常发育的杂交铃，但是杂交铃内部并未得到正常发育的杂交种F1（如图5所示），而授粉后注射营养液的210个杂交铃，得到了32个杂交铃，成铃率提高了11.8%，且杂交铃内部得到了与自然授粉一样正常发育的杂交种F1（如图6、图7所示），且发芽率与‘金花葵3号’和‘邯818’无显著性差异（如表4所示）。

表3 不同杂交方法对试验结果的影响

表4 不同作物发芽率统计

图5 ‘金花葵3号’、‘邯818’和杂交种F1gDNA特异性引物PCR检测结果

图6 嫁接苗杂交后正常发育但败育的的金花葵铃

图7 嫁接苗杂交注射营养液后发育成的金花葵铃

2.3 杂交种F1真实性SSR扩增检测

利用‘金花葵3号’和‘邯818’特异性引物分别PCR扩增双方gDNA，分别得到了一条约900 bp和1300 bp清晰的特异性条带；双重PCR扩增杂交种F1的gDNA，得到了包含900 bp和1300 bp的两条特异性条带（如图5所示），与2.1镜检结果相互印证，证实杂交种F1为阳性，为真实杂交种。

3 讨论与结论

目前，各种作物利用常规杂交选育技术选育新品种仍然是主要方法，但也遇到了诸如亲本遗传资源狭窄以及难于选育突破性品种的局面。虽然远缘杂交在一定程度上可以获得成功，但是其后代还无法按照育种家设想的方向整合双亲优良性状并稳定遗传，这需要我们进一步探索其内在规律。本研究以‘金花葵3号’和‘邯818’为亲本进行远缘杂交，同时获得了‘金花葵3号’以及杂交种的染色体倍性和数量，首次证实‘金花葵3号’为基因组含有66条染色体的二倍体植物，为今后继续研究远缘杂交提供了理论和物质基础。以异源四倍体陆地棉‘邯818’为母本，和‘金花葵3号’无论是直接杂交还是注射营养液均无法得到正常发育的杂交铃。这一研究结果和许凤等[2]的研究结果相似。以‘金花葵3号’为母本，虽然直接杂交可以获得杂交铃，但是杂交铃未见正常发育的杂交种F1籽粒，而注射营养液后却得到了正常发育的杂交种F1籽粒，且F1可以正常生长，但是无法结实。由此可见，营养液在杂交后幼胚发育初期有助于幼胚的发育。因此，在远缘杂交研究中，亲本的合理选择对试验结果的影响很大，这一现象是否与双亲染色体数目有关，值得进一步研究。我们大胆推测，以染色体数量较多的亲本为母本，在授粉后外施营养液，会有助于提高杂交成功率和结实率。下一步，将通过染色体加倍技术使杂交种F1染色体获得加倍，以期得到花粉可育、性状稳定遗传的新种质。

图8 自然生长金花葵自花授粉后发育成的金花葵成铃