Kisspeptin/KISS1R系统在妊娠和辅助生殖领域中的研究进展和应用前景

彭乔，桂文武

1996年学者们[1]第一次在人类恶性黑色素瘤杂交体系中发现了一种新的互补DNA[complementary DNA，CDNA(cDNA)]:KISS1，位于1区染色体q32～ q41[2]，编码后生成含145个氨基酸的多肽Kisspeptin。该多肽可被蛋白酶水解为4类具有生物活性的短肽：Kisspeptin 54、Kisspeptin 14、Kisspeptin 13、Kisspeptin 10。以上短肽C 端均具有 Arg-Phe-NH 2结构，是与其受体KISS-1 receptor(G 蛋白偶联受体，以下简称KISS1R)结合的保守位点，二者结合后将形成含7个α 螺旋的疏水性跨膜区域，激活磷脂酶C引起胞内钙离子浓度增加，激活细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)信号通路[3]。

KISS1基因及其受体KISS1R广泛分布于全身多组织器官，不仅可表达于中枢神经系统如下丘脑的前腹侧室周核(anteroventral periventricular,AVPV)及弓状核(arcuate nucleus，ARC)[4]；在外周组织器官，如胰腺、性腺等也有一定表达[5]。近年来， Kisspeptin/KISS1R系统在女性下丘脑-垂体-卵巢(hypothalamic-pituitary-ovary,HPO)轴中的调控作用不断得到证实，指出其与促性腺激素释放激素(gonadotrophin releasing hormone，GnRH)的表达密切相关[6]。下丘脑中合成分泌GnRH的神经元，大约有90%中存在KISS1R mRNA的表达,且Kisspeptin对GnRH的分泌促进呈一定剂量的依赖性[7]。此外，Kisspeptin/KISS1R系统除了可以刺激HPO轴调控女性生殖内分泌、卵巢及子宫上的 Kisspeptin/KISS1R系统更是直接在妊娠过程中发挥了重要调节作用。在这篇综述中，我们重点研究了Kisspeptin及其受体KISS1R在生殖系统(包括中枢HPO轴卵巢、子宫、胎盘)中的表达和调控，并强调了Kisspeptin/KISS1R在辅助生殖领域中的潜在应用价值。

1 Kisspeptin/KISS1R系统与女性周期性生殖内分泌调节

1.1 调控生殖内分泌轴活动

Kisspeptin是一类信号传导神经肽，与其受体KISS1R结合后形成一种7次跨膜G蛋白偶联受体，通过激活磷脂酶C发挥细胞间信号转导功能[8]。作为过去10年生殖内分泌领域的重大研究热点，Kisspeptin/KISS1R被证实在哺乳动物青春期启动和中枢性生殖内分泌调节中起着基础性作用[9-10]。Kisspeptin由下丘脑上第三脑室吻侧室周核(the rostral periventricular region of the third ventricle ，RP3V)和ARC产生[11]，通过神经元投射及KISS1R作用，激活下丘脑GnRH神经元，刺激GnRH分泌[11-12]。GnRH作为控制生殖的主要神经激素，Kisspeptin是其最主要的调节因子之一，这一观点已得到学术界广泛认同[13]。下丘脑作为内分泌的开关和中央枢纽，其低频GnRH脉冲的出现是青春期启动的最早信号[14]。Kisspeptin/KISS1R系统作为HPO轴的上游刺激因子，是青春期启动和发展的关键,对生殖神经内分泌的重要作用不言而喻。2016年Maggi等[15]的一项研究证实，KISS-1表达生成的Kisspeptin与下丘脑GnRH神经元结合，影响GnRH激素的释放。进一步探究则发现Kisspeptin刺激促性腺激素释放的作用依赖于GnRH的分泌，Kisspeptin是GnRH活化的标志，增强了GnRH的表达[16]。虽然Kisspeptin对HPO轴有直接调控作用，但同时有研究指出，HPO轴部分负反馈调节和激素水平的反应仅用Kisspeptin/KISS1R系统尚不能得以完全解释，可能还依赖于其他某些关键中枢[17]。Kisspeptin/KISS1R是否与其他中枢之间存在更为复杂的协同作用，这需要学者们进一步探索。

1.2 促卵泡成熟及诱导排卵

GnRH的释放刺激促性腺激素[卵泡刺激素(follicular stimulating hormone,FSH)及黄体生成素(luteinizing hormone,LH)]的分泌，调控了卵泡成熟和排卵过程[18-19]。下丘脑上多处核团存在KISS1基因及其受体的表达[20-21]。学者们首先使用了大量动物模型来探究Kisspeptin对月经周期卵泡的影响。Matsui等[22]和Sebert等[23]曾分别观察了青春期前雌性大鼠和发情期母羊，通过Kisspeptin处理后，诱导二者出现了排卵前LH激增，并成功诱发排卵。Sebert等[23]还发现，出现LH激增的母羊血浆内，其雌二醇(estradiol，E2)浓度较无LH激增的母羊高。研究发现，下丘脑不同核团的KISS1神经元作用不一[24]。位于下丘脑AVPV的KISS1神经元参与E2正反馈调节，促进GnRH 分泌；位于ARC的KISS1神经元则参与调控GnRH的基础性脉冲式释放。除中枢外，卵巢上的Kisspeptin/KISS1R也直接参与了这一过程，并且在调节孕激素分泌的同时而不影响雌激素的产生[25-26]。而后Jayasen等[25]皮下注射Kisspeptin-54对女性患者进行促排卵治疗，结果发现：① 注射后卵子成熟率增加，并且随着Kisspeptin剂量增加，成熟卵子的绝对数也增加；② 注射Kisspeptin后12 h内，LH及孕酮(progesterone，P)出现了激增，并且最终获得了较好的生化妊娠率和临床妊娠率,活产率达到83.8%。可以得出，Kisspeptin是GnRH依赖的LH分泌的有力刺激因子，且Kisspeptin有望运用于辅助生殖技术(assisted reproductive technology，ART)提高获卵率和受孕成功率[27-28]。但关于这方面的人类研究样本量较少，Kisspeptin是否比传统药物更贴合生理过程、更高效，还需要进一步的研究佐证。

2 Kisspeptin/KISS1R系统与妊娠

2.1 维持妊娠

良好的滋养层细胞浸润是成功妊娠的前提，研究表明，在人体外周组织中，KISS1和KISS1R在胎盘滋养层细胞中表达最高,对胚胎的植入和内膜蜕膜化具有重要调节作用[29]。用Kisspeptin处理动物黄体细胞(如大鼠、青海牦牛)后，可直接促进P分泌，显著增加P浓度[30-31]，P在孕早期黄体功能的支持、妊娠维持等方面具有重要作用。同时有证据证实孕妇妊娠期血清中Kisspeptin水平随孕周的增加而逐渐升高，直至足月[25]。前期研究发现，孕妇早期妊娠胎盘和足月妊娠胎盘中KISS1 mRNA水平无显著差异[32]。有趣的是，另有两项独立研究表明，血浆Kisspeptin-54水平(采用western blotting和免疫组织化学方法)在早期妊娠中显著增高[33-34]，这说明胎盘中的KISS1表达水平不一定反映血浆Kisspeptin水平。这可能源于胎盘质量和滋养层细胞数的增加，使外周循环Kisspeptin浓度增加；同时由于各试验样品处理时间和采集方法不同，影响了Kisspeptin测定值。未来的研究还需要进一步探究解决血浆Kisspeptin水平和胎盘KISS1表达之间似乎不一致的问题。

2.2 预测妊娠结局

流产是妊娠早期最常见的并发症，发生率约为20%[35]。由于流产常是不可逆转的，预防可能是干预的唯一办法。越来越多的证据表明，血浆或血清Kisspeptin (Kisspeptin-10或Kisspeptin-54)水平在鉴别确诊流产方面或许具有更高的准确性[36]。2016年，寇连翠等[30]在自然流产大鼠模型中发现，流产组大鼠黄体表达的Kisspeptin/KISS1R阳性细胞数明显减少，分泌E2、P的功能明显减弱,这一现象在人类复发性流产组中得到类似证实[37-38]。宾西法利亚大学一项病例对照研究显示[36](图1，附文尾)，血浆Kisspeptin水平对流产有较高的诊断价值[Kisspeptin的ROC曲线下面积：0.899±0.025,人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG):0.775±0.040]。为避免过度保胎治疗，寻找一种早期评估妊娠结局的高准确性的临床指标显得尤为重要。以上数据强烈表明，血浆中Kisspeptin水平可以被认为是早期妊娠存活率的一个新的生物标志物。

另外，由于Kisspeptin与胎盘滋养层细胞的浸润相关，妊娠期外周血 Kisspeptin水平的减少与孕中后期相关并发症，如胎儿生长受限、子痫前期(preeclampsia，PE)存在一定相关性[3]。PE是妊娠期特有的一类高血压疾病，指妊娠20周后首次出现高血压和蛋白尿，伴或不伴有水肿与高尿酸血症，导致母体及胎儿围产期出现不良结局的风险增高[39]。2006年，Farina等[40]报道了他们的研究，即通过检测正常和PE孕妇血液中7个游离基因的mRNA水平，尝试找出预测PE的生物标志物，首次纳入了KISS1。结果发现PE患者中KISS1表达水平低于对照组，但该研究中PE患者样本量较小(仅6例)。随后另有两项独立试验回顾性测定了后期被诊断为PE患者妊娠早期的血清Kisspeptin水平，发现孕11～14周或孕16～20周的Kisspeptin水平明显低于同期正常妊娠组[34]。Farina等[40]在PE患者体内进一步发现，血浆Kisspeptin (Kisspeptin-10)水平与24 h蛋白尿(r=-0.299,P<0.01)及平均动脉压(r=-0.316,P<0.01)呈负相关，提示血浆Kisspeptin (Kisspeptin-10)水平与该病严重程度密切相关。一直以来，妊娠期高血压疾病都是产科医生面临的严峻考验， 2014年柳叶刀上发表的一篇WHO孕产妇死亡原因的系统回顾中指出：PE死亡率可达到10%～15%[41]。故有专家建议将Kisspeptin作为临床预测和诊断PE的常规生物标志物[42]。但由于目前市面上缺乏统一的测定试剂和测定工具，并且缺乏大样本来证实其精确性和安全性，血浆Kisspeptin水平是否可大量用于母亲和胎儿或新生儿健康状况的诊断和预测，还需要进一步研究确定。

3 Kisspeptin/KISS1R系统与辅助生殖技术

3.1 调控胚胎着床

胚胎成功着床是ART助孕的头道关卡[43]。胚胎着床是指囊胚附着在子宫上皮并在一定程度上侵入底层基质细胞的特异性过程[44]，它受到性腺和激素水平的高度调控，只有在胚胎达到囊胚期和子宫达到最佳容受期时才会发生[45]。女性不孕的一个主要原因是反复胚胎着床失败。而Kisspeptin/KISS1R系统则被证明参与了胚胎植入和蜕膜化[29]。

有研究发现[46]，将KISS1或KISS1R基因敲除后雌性小鼠的卵子与野生型雄性小鼠的精子结合时，受精卵在植入前发育正常。然而,孵化后的囊胚(KISS1或KISS1R杂合子)可以植入到野生型雌性小鼠子宫基质细胞内，在基因敲除后的雌性小鼠子宫内却不行，只能实现定位，却没有发现任何胚胎侵入滋养层细胞的证据，尽管二者外周血中雌孕激素水平均正常。为了支持这一发现，该研究组在另一试验中外源性补充Kisspeptin[47]，发现经治疗后，表达KISS1R的小鼠囊胚对子宫内膜的黏附随之增加。因此，子宫Kisspeptin/KISS1R信号系统的破坏可以解释胚泡与子宫内膜黏附不足这一现象。此外，KISS1和KISS1R基因缺失的雌性小鼠子宫小且薄，呈线状，几乎完全没有子宫内膜腺体[47]。后期E2分泌启动，子宫的生长发育可以部分恢复，但不能完全挽救腺体的生成或发育，这提示腺体发育不完全依赖卵巢雌激素的分泌，但同时可能还依赖子宫上Kisspeptin/KISS1R表达。除了腺体生成减少外，挽救后的腺体，其表达Forkhead box蛋白A2(FOXA2)水平也明显降低，据报道FOXA2可以调节子宫内膜腺体的发育和功能[48]。对人类而言，到目前为止，缺乏直接证明子宫Kisspeptin或KISS1R表达的缺失与植入失败相关的临床研究。然而，最近一项来自巴基斯坦阿迦汗大学生物医学实验室的研究显示，在接受卵胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)的女性中，血清低Kisspeptin水平可能与植入失败有关[49]。他们发现，不明原因不孕的妇女血清Kisspeptin水平明显低于(在开始降调节方案前，月经第2 d抽血测定)因男性因素所致不孕的妇女。并且前者ICSI后着床成功率更低。大量接受雌、孕激素调控的因子，已被证实在胚胎着床过程中发挥作用，其中就包括Kisspeptin及其受体KISS1R[50-54]。Kisspeptin/KISS1R系统有望成为提高ART成功率和治疗反复着床失败、复发性流产的新靶点，具有极大的研究前景。

3.2 防止卵巢过度刺激综合征

卵巢过度刺激综合征(ovarian hyperstimulation syndrome, OHSS)是一种严重的、有致死风险的医源性卵巢刺激并发症，常发生在促排卵、体外受精(in vitro fertilization，IVF)等ART过程中[55]。主要表现为：卵巢体积显著增大、高17-βE2浓度水平、高血管通透性(high vascular permeability，HVP)、腹水、胸腔积液、肾灌注减少、血栓并发症，重度OHSS可导致患者死亡，近年来重度OHSS的发生率达0.5%～5%[56]。关于OHSS的发病机制目前仍不清楚，但可以确定的是其临床症状主要来源于全身血管通透性的升高，而血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是其中最重要的中介[57]。VEGF通过与内皮细胞中的VEGF受体-2 (VEGFR-2)结合并磷酸化，使局部毛细血管通透性增加。此外，VEGF还是血管通透性的增敏剂，其效力比组胺强5 000倍[56]。多个独立性研究发现，Kisspeptin/KISS1R系统抑制VEGF的表达[57-59]。2017年陈子江团队报道了一篇研究[58]，指出在人类脐静脉内皮细胞模型(human umbilical vein endothelialcells，HUVECs)中，高水平的雌激素(OHSS的特征之一)作用于雌激素受体增加了VEGF和一氧化氮水平，同时还抑制了KISS1R的表达；在高风险OHSS患者中，黄体颗粒细胞上KISS1R mRNA受到抑制。而对OHSS大鼠外源性注射Kisspeptin-10后，大鼠卵巢和肺组织中VEGF水平下降， KISS1R的表达升高。以上3种研究模型支持了同一结论，即 Kisspeptin-10通过激活KISS1R、抑制VEGF、防止了血管通透性升高，进而抑制了OHSS的发生。鉴于 OHSS 具有高危险性,如何预防 OHSS 的发生一直是ART研究的重点。部分临床工作者选择促性腺激素释放激素激动剂(gonadotropin releasing hormone agonist，GnRHa)代替hCG扳机，尽可能降低OHSS发生风险，但针对高危个体，GnRHa仍不能避免OHSS。一项来自欧洲的试验数据表明[60]，使用 Kisspeptin-54 可以减少IVF女性 OHSS的发生，发生率仅为 0．18%～1．40%。另一个伦敦单中心回顾性队列研究比较了对高风险OHSS患者运用不同扳机药物后引起OHSS的临床病例，发现 Kisspeptin 组女性取卵后与hCG组、GnRHa组相比，前者发生OHSS的比例更低、症状更轻[61]，与前述研究结果一致。基于Kisspeptin/KISS1R对生殖内分泌的重要调控作用，以及其对OHSS发生机制上的预防，未来Kisspeptin在辅助生殖领域中将具有极大的运用潜能。但目前Kisspeptin 的报道大多局限于基础试验和动物模型，是否能安全应用于人类，成为新的临床治疗剂，还依赖于更精确的工具设备及大数据研究。

4 讨论及展望

既往研究已经证实，Kisspeptin/KISS1R系统的表达与GnRH的分泌改变具有同步性[62]，GnRH神经元表达 KISS1R mRNA，Kisspeptin则通过与该神经元表面KISS1R结合，进而促进GnRH 的释放[63]；反之， Kisspeptin阻滞剂却可抑制GnRH的分泌[9]。Kisspeptin/KISS1R系统在女性生长发育及月经周期中的内分泌作用机制已得到广泛认可，不仅可以促卵泡生长、提升卵泡质量，还具有与LH相似的功能：预测排卵。该系统不仅可以直接调节中枢HPO轴的各个部分，在妊娠期还可以通过外周组织，如子宫、胎盘上的Kisspeptin/KISS1R信号系统发挥胚胎调控作用。具体而言，子宫上表达的Kisspeptin/KISS1R系统调节胚胎植入和蜕膜化，子宫和胎盘上的KISS1系统则共同调节胎盘形成和行使功能[29]。Kisspeptin/KISS1R系统是公认的VEGF抑制剂，因此学者们推测Kisspeptinp/KISS1R系统有望应用于ART，防止OHSS的发生。但是，当我们尝试开发Kisspeptin或KISS1R作为诊断或判断妊娠期疾病预后的生物标记物，甚至将Kisspeptin作为临床治疗用药时，需谨慎行之。因为Kisspeptin、KISS1R的测定和制备目前尚缺乏可靠的实验工具及方法，目前报道中的研究对象主要为Kisspeptin-10和Kisspeptin-54，其他亚型的作用情况需要进一步研究。同时为提高对Kisspeptin/KISS1R系统信号调控机制及其作用的了解，保证临床使用安全性，尚需进一步构建和完善动物及实验模型。若能在上述问题上实现学术突破，中枢及外周Kisspeptin/ KISS1R系统有望应用于辅助生殖领域，成为治疗女性不孕症的新星。

图1 不同妊娠类型下血清Kisspeptin/hCG浓度水平