脯氨酸羟化酶GhP4H2在棉花纤维发育中的功能研究

高 璐 许文亮

脯氨酸羟化酶GhP4H2在棉花纤维发育中的功能研究

高 璐1,2许文亮1,*

1华中师范大学生命科学学院 / 遗传调控与整合生物学湖北省重点实验室, 湖北武汉 430079;2山西农业大学小麦研究所, 山西临汾 041000

阿拉伯半乳聚糖蛋白(arabinogalactan proteins, AGP)在棉花纤维发育过程中发挥重要作用。AGP由富含羟脯氨酸的主链蛋白和大量II型阿拉伯半乳聚糖(arabinogalactan, AG)侧链组成, 其合成过程要经历2次翻译后修饰, 首先是氨基酸主链上的脯氨酸被脯氨酸羟化酶(prolyl-4-hydroxylases, P4H)羟基化, 随后在糖基转移酶(glycosyltransferases, GT)催化作用下将阿拉伯半乳聚糖或寡糖添加到羟脯氨酸残基上。我们前期利用P4Hs的抑制剂处理棉花离体胚发现, 棉纤维伸长受到抑制, 暗示P4H参与棉纤维生长发育过程。为深入研究P4H在棉纤维发育中的功能, 我们从棉花中分离鉴定了1个在棉纤维发育过程中高量表达的脯氨酸羟化酶基因。本研究分别构建了过表达和RNA interference (RNAi)载体, 通过农杆菌介导法转化棉花, 获得转基因植株, 发现过表达转基因棉花株系T1~T3代成熟棉纤维变短, AGP含量增加, AG多糖侧链也发生变化。对过表达转基因植株和野生型植株棉纤维的转录组分析表明, G正调控包括AGP在内的细胞壁糖蛋白基因的表达。基于以上研究, 我们推测可能主要通过影响AGP糖链组分调控棉纤维生长发育。

棉纤维; 阿拉伯半乳聚糖蛋白; 脯氨酸羟化酶

棉花作为世界上最大的纤维作物和纺织工业原料, 品质是其经济价值的重要考量因素。棉纤维是由棉花胚珠外珠被表皮层的单细胞发育而成, 是自然界最长的单细胞之一。细胞壁作为棉纤维的重要组分, 其合成过程直接决定着棉纤维的品质参数[1], 它是一个复杂的动态结构, 由90%高分子量的多聚物和少量糖蛋白组成[2]。虽然糖蛋白组分占比很少, 却是细胞壁形态构成和功能发挥的重要因子。富含羟脯氨酸糖蛋白(hydroxyproline (Hyp)-rich glycoproteins, HRGP)代表细胞壁糖蛋白的一个大家族, 根据其核心蛋白的糖基化程度, 可分为高度糖基化的阿拉伯半乳聚糖蛋白(arabinogalactan proteins, AGP), 中度糖基化的伸展蛋白(extensins, EXT)以及轻度糖基化的富含脯氨酸蛋白(proline-rich proteins, PRPs) 3类[3-5]。PRP广泛存在于不同作物中且功能不等, 如参与玉米胚的发育[6-7]、响应大豆干旱和盐胁迫应答[8]等。我们前期从棉花cDNA文库中分离了3个PRP家族基因, 命名为、和, 发现在下胚轴和根中高量表达,在棉花开花后10 d (days post anthesis, DPA)胚珠中优势表达[9]。在拟南芥中表达基因增强了转基因拟南芥对盐和ABA的敏感性[10]。RNAi转基因棉纤维的长绒和短绒均增长, 酵母双杂交表明, GhPRP5可形成同源和异源二聚体发挥功能, 推测通过复杂的调控网络影响细胞壁的合成从而影响棉纤维的发育[11]。AGP可能是自然界中翻译后修饰程度最高的蛋白, 其合成过程包括N末端信号肽序列的切割、由脯氨酸羟化酶(prolyl 4-hydroxylases, P4Hs)催化的脯氨酸残基的羟基化、GPI锚的修饰和羟脯氨酸残基上的阿拉伯半乳聚糖糖基化。它是一类O-糖基化蛋白, O-糖基化部位主要发生在含有丝氨酸(Ser)和羟脯氨酸(Hyp)的肽链中[12], 广泛参与细胞膨胀、细胞分化、生殖发育、体细胞胚胎发育、木质部分化、非生物胁迫应答、激素信号应答等过程[5]。AGP功能的发挥很大程度上依赖于占到整个分子量90%以上的糖侧链[13], 拟南芥突变体中AGP分子的糖侧链缺失岩藻糖, 使得根长明显变短[14]。在中, TTS蛋白参与花粉管的伸长, 但去糖基化的TTS蛋白丧失该功能[15]。近年来, 已经筛选出大量编码AGP合成的基因, 根据核心蛋白中氨基酸的组成, AGP可分为典型性和非典型性两大类, 成束蛋白样阿拉伯半乳聚糖蛋白(Fasciclin-like arabinogalactan proteins, FLAs)作为典型性AGP的代表, 广泛存在于拟南芥[16]、水稻[17]、小麦[18]、毛果杨[19]、大麻[20]、陆地棉[21]、海岛棉[22]等多种植物中。我们之前从棉花中分离了19个编码FLA的基因, 其中的3个()在10 DPA纤维中优势表达。我们进一步的研究发现, 过表达可以促进纤维伸长而抑制表达减缓了纤维起始和伸长。免疫组学分析显示,影响AGP组分尤其是AG多糖侧链的合成[21]。随后, 我们又分离了糖基转移酶基因GT31家族成员, 发现其参与AGP (主要是FLA) II型AG糖链β-1,3-半乳糖苷链的合成, 通过调控的表达, 导致转基因株系棉纤维细胞壁的形态结构发生明显变化[23]。综上, AGP多糖侧链在棉纤维发育过程中发挥重要的作用, 但对于催化脯氨酸羟基化的脯氨酸羟化酶在棉纤维发育过程中的作用还不清楚。

P4H是普遍存在于动物和植物中的一种2-氧化戊二酸双加氧酶, 主要定位于内膜系统, 其功能的发挥需要Fe2+、α-酮戊二酸、O2等的参与[24]。动物等高级生物中P4H分为两大类, 影响胶原蛋白合成的C-P4H和缺氧诱导HIF-P4H。C-P4H是胶原蛋白合成的关键因子, 这类P4H以α2β2四聚体结构发挥功能, β-基序形成二硫键异构酶, α-基序则形成催化亚基, 催化底物氨基酸序列-X-Pro-Gly-中的Pro羟基化[25-26]。目前植物中关于P4H的报道还较少, 与动物中C-P4H不同的是其只含有α催化亚基, 催化底物中位于Ala、Gln、Hyp、Pro、Ser、Thr和Val之后的Pro羟基化, 但位于其他氨基酸之后的第1个Pro不能被羟基化。P4H催化的底物EXT中的Pro为连续的2~4个单元, 并且始终毗邻Ser(Ser-(Pro)2-4), 羟基化后形成Ser-(Hyp)2-4。当AGP作为催化底物时, AP/PA/SP/TP重复序列是其羟基化的敏感位点。而PRPs的PPVX [KT]、KKPCPP和PPV序列以及其他富含Pro的嵌合蛋白XPnY基序是其催化的靶序列。光谱测定和生物信息学方法预测到了拟南芥中AtPRP4 (富含32.5% Pro)、At1g09750、At1g31580 (含27%~28% Pro)、At3g08030、At2g10940 (含6%~8% Pro)催化底物序列Pro的定位, 证明了Pro羟基化序列的多样性和特异性[27]。莱茵衣藻中共有10个基因, 但只有的功能得到证实, 缺陷型导致细胞壁的合成受阻[28]。

棉花是世界上最重要的经济作物之一, 目前关于棉花中的报道还尚属空白。P4H功能的发挥离不开保守残基与2-氧戊二酸盐(2-oxoglutarate)和Fe2+的结合。3,4-二羟基苯甲酸乙酯(ethyl-3,4-dihydroxybenzoate, EDHB)和α,α-联吡啶(α,α-Dipyridyl, DP)是P4H酶的2种抑制剂, EDHB可以特异结合2-oxoglutarate, DP则通过螯合Fe2+抑制P4H酶活[29]。我们前期用不同浓度梯度的EDHB和DP处理棉花离体胚珠后, 棉纤维伸长受到严重抑制, 且抑制程度与抑制剂浓度呈正相关, 说明参与棉纤维生长发育[12]。随后, 我们从棉花基因组中识别了30个可能编码P4H的基因, 许多P4H家族基因在纤维发育的不同阶段高量表达, 进一步表明这些基因可能在纤维发育过程中起作用。为研究P4H在棉纤维发育过程中的功能, 本研究克隆了一个在棉纤维伸长期高量表达的P4H家族基因, 通过农杆菌介导法转化棉花, 获得转基因棉花植株, 旨在了解P4H在棉纤维发育过程中的功能, 为棉纤维发育的分子机制提供新的视野。

1 材料与方法

1.1 植物材料

本研究选用陆地棉(L.) Corker 312品种为棉花遗传转化受体。1/2 MS培养基培养棉花无菌苗5~6 d, 将棉花下胚轴切成10 mm左右的小段, 并用含有过量表达载体或RNAi载体的农杆菌LBA4404悬浮液浸染15 min, 然后将外植体转移到共培养培养基上(不含任何抗生素)在28℃ (16 h光照/8 h黑暗)下共培养2 d, 后续详细继代培养步骤参照Qin等[23]的方法。获得的转基因幼苗转移至温室土壤中用于目的基因的鉴定和遗传分析。

1.2 棉花基因组DNA提取

取棉花幼苗2 g左右幼叶, 利用CTAB法提取基因组DNA[23]。

1.3 载体构建

设计带有I和I酶切位点的OE引物(表1), 利用Primer STAR高保真酶扩增开放阅读框序列, 连接到克隆载体pSK上, 测序验证没有碱基突变后构建到表达载体pBI121上获得pBI121过表达载体。

两端酶切位点为H I和I的L1引物(表1)扩增正义链, 酶切位点为I和I的L2引物(表1)扩增反义链, 正义链和反义链中间有一个基因内含子(Intron), 两端酶切位点分别为I和I。将正义链-Intron-反义链序列构建到pBI121质粒中, 获得pBI121RNAi载体[23]。

1.4 RNA提取和实时定量RT-PCR

利用TianGen RNA试剂盒提取棉花RNA。逆转录获得cDNA, 将各个样品的cDNA稀释到浓度相当后对基因进行实时定量RT-PCR分析[23]。棉花泛素基因(,)作为内参, 本研究所用基因RT-PCR引物见表1。

1.5 棉纤维AGP的分离、纯化及定量分析

按照Qin等[23]的方法, 取10 g冷冻干燥的10 DPA纤维, 加入液氮研磨成粉末后, 加入10 mL缓冲液(50 mmol L-1Tris-Cl, 10 mmol L-1pH 8.0 EDTA, 0.1% β-巯基乙醇, 1% (w/v) Triton X-100), 4℃孵育3 h。14,000´离心10 min, 取上清加入10 mL乙醇, 4℃孵育过夜。离心弃上清, 5 mL 50 mmol L-1Tris-Cl重悬沉淀, 冷冻干燥过夜。350 µL 1% NaCl重悬样品, 加入350 µL的β-Yariv, 混匀, 4℃过夜。14,000´离心1 h, 1% NaCl洗涤沉淀3次, 甲醇洗涤沉淀2次去除β-Yariv, 静置干燥, 加入适量二甲基亚砜至沉淀完全溶解, 加入微量亚硫酸钠, 再加入适量超纯水至溶液呈亮黄色, 溶液过PD-10柱脱盐, 所得即为AGP溶液。

AGP浓度测定按Qin等[23]的方法, 配制浓度为1%琼脂糖, 0.02% 叠氮钠(NaN3), 0.15 mol L-1NaCl以及10 μg mL-1β-Yariv的溶液20 mL, 加热至沸腾, 待琼脂糖完全融化后, 将混合液倒入培养皿中, 冷却。用直径为2 mm的玻璃吸管对冷却的凝胶打孔。取1 μL AGP点样, 均匀点入每个孔中, 并选择浓度为0.1~0.6 μg μL-1的阿拉伯树胶作为标样对照。将平板置于黑暗潮湿的环境中过夜。测量每个扩散色圈的直径, 并计算色圈面积, 根据标样绘制标准曲线并计算出各个待测样品的浓度。

1.6 Immuno Dot blot分析

根据Qin等[23]的方法进行Dot blot分析野生型与转基因棉花株系中AGP的差异。分别利用JIM8和JIM13作为一抗, 碱性磷酸酶标记的山羊抗大鼠IgG(H+L)作为二抗进行免疫组织化学反应。

1.7 转录组分析

收取野生型和过表达株系5 DPA纤维,利用Spectrum plant total RNA Kit试剂盒提取总RNA, 纯化后检测RNA的完整性。将完整性好的RNA进行RAN-seq (北京诺禾致源基因公司)。GO (Gene ontology)预测差异基因功能并分类, 以值为依据, 筛选出差异表达基因进行RT-PCR验证。

表1 本研究所用引物

2 结果与分析

2.1 GhP4H2蛋白的系统进化分析和基因表达谱

利用Clustalx、MEGA7.0 (http://www.megasoftware. net/)对拟南芥P4H与棉花GhP4H2进行系统进化树分析(图1-A)发现, GhP4H2与AtP4H2、AtP4H4处于同一个亚支, 亲缘关系最近。

为研究基因在棉花中的表达模式, 提取棉花的根、下胚轴、子叶、真叶、花瓣、花药、15 d胚珠及不同发育时期纤维的RNA, 逆转录后进行实时定量RT-PCR分析。基因在子叶、真叶、花药中高量表达, 在纤维发育的不同时期(0~20 DPA)均有较高水平的表达, 且在5 DPA和9 DPA纤维中保持较高的表达量(图1-B), 暗示可能参与棉纤维伸长过程。

A: 棉花GhP4H2与拟南芥GhP4H蛋白系统进化关系; B:基因在棉花各组织的表达谱。1: 根; 2: 下胚轴; 3: 子叶; 4: 真叶; 5: 花瓣; 6: 花药; 7: 15 DPA胚珠; 8: 0 DPA纤维(含胚珠); 9: 3 DPA纤维(含胚珠); 10: 5 DPA纤维; 11: 9 DPA纤维; 12: 15 DPA纤维; 13: 20 DPA纤维。DPA: 开花后天数。误差线代表标准误差。

A: phylogenetic relationship of GhP4H2 andP4Hs; B: expression analysis ofin different cotton tissues. 1: root; 2: hypocotyl; 3: cotyledon; 4: leaves; 5: petals; 6: anthers; 7: 15 DPA ovule; 8: 0 DPA fiber (with ovule); 9: 3 DPA fiber (with ovule); 10: 5 DPA fiber; 11: 9 DPA fiber; 12: 15 DPA fiber; 13: 20 DPA fiber. DPA: days post anthesis. Error bar represents the standard deviation.

2.2 转基因棉花株系中GhP4H2的表达分析

为研究在棉纤维生长发育过程中的功能, 本研究分别构建了由35S启动子驱动的过表达(overexpression, OE)和RNA interference (RNAi)载体,通过农杆菌介导法转化棉花下胚轴, 获得转基因棉花植株。取不同转基因株系5 DPA和10 DPA纤维进行表达量鉴定表明,基因在RNAi (Ri)株系L16和L28中表达量显著低于WT, 在过表达株系L10和L38中表达量显著增加(图2)。我们后续研究选择RiL16、RiL28、OEL10、OEL38这4个转基因株系进行表型分析。

2.3 GhP4H2转基因棉花成熟纤维表型分析

分析T1~T3代成熟纤维表型变化发现, 与野生型相比,过表达株系的成熟棉纤维长度显著变短, 而RNAi株系没有明显变化。脱绒后比较不同株系种子形态大小, 未发现明显差异(图3), 表明主要影响纤维发育而对胚珠影响较小。

2.4 GhP4H2转基因棉纤维AGP含量分析

考虑到AGP基因数目占了棉纤维HRGP基因的绝大多数[23], 我们推测AGP可能是P4H的首选底物。为研究对AGP合成的影响, 本研究提取了10 DPA纤维AGP进行定量检测。以0.1~0.6 μg μL-1浓度梯度的阿拉伯树胶作对照, 绘制折线图并计算各转基因株系中AGP样品浓度(图4)。RiL28中AGP含量明显低于WT, RiL16中AGP含量有轻微减少; 而过表达株系OEL38中含量显著增加, OEL10中AGP含量有轻微增加, 但未见显著差异。

2.5 GhP4H2影响AGPs多糖侧链的合成

为研究对AGP糖侧链合成的影响, 本研究用不同的抗体进行了Dot blot分析。其中, JIM8、JIM13能够与AGP糖侧链抗原决定簇特异性结合, JIM8特异结合阿拉伯半乳糖侧链, JIM13特异结合β-GlcA-(1,3)-α-Gal-(1,2)-Rha侧链。由图5可知, RNAi株系杂交信号与WT相比减弱, 并且JIM8杂交信号弱于JIM13。过表达株系则呈现相反趋势。说明转基因株系中影响了AGP糖侧链的组成。

A:在不同株系5 DPA纤维中表达分析; B:在不同株系10 DPA纤维中表达分析。RiL16、RiL28表示2个独立的RNAi株系; WT表示野生型; OEL10、OEL38表示2个独立的过表达株系。**表示在0.01水平差异显著。

A and B: quantitative RT-PCR analysis ofexpression in 5 DPA (A) and 10 DPA (B) fibers from independent transgenic cotton lines and wild type. RiL16 and RiL28 represent two independent-RNAi lines; WT represents the wild type; OEL10 and OEL38 represent two independentoverexpression lines. ** means significant difference at the 0.01 probability level.

A:转基因棉花与WT成熟种子和纤维表型比较; B:转基因棉花与WT成熟纤维长度比较。**表示在0.01水平差异显著。株系名称缩写同图2。

A and B: measurement and statistical analysis of mature fiber length and seed size of the transgenic cotton plants and wild type. ** means significant difference at the 0.01 probability level. Abbreviations of lines name are the same as those given in Fig. 2.

A: 不同样品AGP特异反应色圈。B: 阿拉伯树胶标准曲线; 横坐标代表AGP浓度, 纵坐标代表对应的色圈面积。C: 不同样品AGP含量。0.1~0.6 (μg μL-1): 阿拉伯树胶浓度。**表示在0.01水平差异显著。株系名称缩写同图2。

A: halos of different samples from transgenic lines and wild type. B: standard curve; Abscissa: the AGPs concentration; Ordinate: the area of the corresponding halos. C: the AGPs content of different samples from transgenic lines and wild type. 0.1–0.6 (μg μL-1): gum arabic concentration. ** means significant difference at the 0.01 probability level. Abbreviations of lines name are the same as those given in Fig. 2.

-: PBS阴性对照。+: 1 mol L-1arabic gum阳性对照。株系名称缩写同图2。

-: PBS negative control. +: 1 mol L-1arabic gum positive control. Abbreviations of lines name are the same as those given in Fig. 2.

2.6 GhP4H2影响棉纤维细胞壁相关基因的表达

为研究在棉纤维发育过程中的调控通路, 取野生型和过表达株系OEL38的5 DPA纤维进行转录组测序分析。本研究主要关注细胞壁相关基因。与WT相比, OEL38株系202个上调差异表达基因中与细胞壁合成相关的有15个(图6-A), 其中编码HRGP的基因有8个, 占到细胞壁基因的53.3%,、属于AGP类,、属于EXT类,、、、属于PRP类。因此推测这些编码HRGP的基因很可能是作用的靶基因。选择这8个基因进行RT-PCR表达验证(图6-B)发现, 这8个基因在OEL38中表达量均显著升高, 说明可能通过催化这些底物来调控棉纤维发育。

2.7 GhP4H2影响糖基转移酶基因(GhGalTs)的表达

我们之前的研究显示,参与棉纤维发育过程[23]。位于下游, 为研究对表达的影响, 本研究选择家族部分基因进行表达分析(图7)。选择的7个基因中有4个基因(和)在过表达株系中的表达量发生变化, 表明可能影响了AGP糖基化过程, 这可能是AGP糖侧链发生改变的原因。

3 讨论

先前有研究发现,参与拟南芥低氧应答, 过量表达致使拟南芥发生根毛增长, 毛状体缺失, 种子变小等变化, 同时导致与缺氧应答相关基因表达量升高。转录组数据显示,还参与光合作用、JA信号转导、植物激素调控等过程[30]。另外, 有研究表明, AtP4H5分别通过与AtP4H2和AtP4H13形成异源二聚体发挥Pro羟基化功能, 并且优先羟基化EXT, 三者共同调控拟南芥根毛的伸长[31]。敲除会促进番茄根的伸长和叶子的发育, 免疫组学分析显示, 与JIM8特异性结合的AGP糖链组分缺失[32]。拟南芥和突变体中, 根毛相对于野生型都变短, DP和EDHB处理也会抑制根毛的伸长[31]。前期我们分别用DP和EDHB处理棉花离体胚发现, 棉纤维的生长发育受到了明显的抑制, 推测参与调控棉纤维的生长发育[12]。本研究克隆了基因获得过表达和RNAi不同株系转基因棉花, 对T1~T3代成熟棉铃进行表型分析发现,-RNAi株系长绒与WT相比并没有明显变化, 这可能是由于基因功能冗余的原因。而OE株系的成熟纤维明显短于WT。Dot blot分析显示, JIM8和JIM13的杂交信号均增强。我们前期证实促进棉纤维的生长发育, 免疫组学分析显示,转基因株系AGP侧链糖组分发生不同程度的变化, 其中过表达株系中JIM13杂交信号减弱, 说明过表达株系中与JIM13特异结合的AGP表位抗原决定簇减少[21]。随后我们发现过量表达的棉纤维伸长受到抑制, 经免疫组学分析, JIM8和JIM13的杂交信号均增强, 表明过量表达会增加与JIM8和JIM13特异结合的AGP表位抗原决定簇丰度[23]。本研究与过表达棉纤维取得的结果一致, 我们推测过表达转基因棉纤维变短的原因与类似。而在RNAi株系中AGP变化的程度可能不足以明显影响纤维发育。前期我们的结果显示,正调控基因的表达[23], 本研究依据转录组及RT-PCR结果, 证实筛选到的8个表达AGP、EXT、PRP的差异基因受调控, 可能是其下游靶基因, 后续又发现影响下游的表达, 暗示GhP4H2不仅仅影响HRGP羟基化, 对参与糖基化的糖基转移酶基因的表达也有影响, 而转基因株系中AGP的变化很可能正是由于GhP4H2与GhGalTs协同调控引起。但过表达株系成熟纤维表型差异是否与AGP核心蛋白变化有关？AGP可能是GhP4H2优先催化的底物, EXT或PRP也是其作用底物吗？这些问题都有待深入研究。

A: 细胞壁相关基因的主要类别; B: 糖蛋白相关基因的表达验证。PRP: 富含脯氨酸蛋白; AGP: 阿拉伯半乳聚糖蛋白; EXT: 伸展蛋白; PAL: 苯丙氨酸解氨酶。**表示在0.01水平差异显著。株系名称缩写同图2。

A: major classes of the upregulated cell wall genes in transgenic fibers; B: expression analysis of genes encoding glycoproteins. PRP: proline-rich protein; AGP: arabinogalactan protein; EXT: extensin; PAL: phenylalanine ammonia-lyase. ** means significant difference at the 0.01 probability level. Abbreviations of lines name are the same as those given in Fig. 2.

*、**分别表示在0.05和0.01水平差异显著。株系名称缩写同图2。

* and ** mean significant differences at the 0.05 and 0.01 probability levels, respectively. Abbreviations of lines name are the same as those given in Fig. 2.

4 结论

本研究克隆了一个脯氨酸羟化酶基因, 该基因通过影响基因和糖基转移酶基因的表达来影响AGP的合成。过表达株系成熟纤维变短与AGP含量增加和糖侧链组分改变相关, 而RNAi株系成熟纤维长度未发生明显变化, 可能是由于基因功能冗余导致。推测过表达基因株系出现的表型差异是由AGP糖侧链组分变化所致,影响棉花纤维发育的分子机制还需进一步研究。

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GhP4H2 encoding a prolyl-4-hydroxylase is involved in regulating cotton fiber development

GAO Lu1,2and XU Wen-Liang1,*

1Hubei Key Laboratory of Genetic Regulation and Integrative Biology / School of Life Sciences, Central China Normal University, Wuhan 430079, Hubei, China;2Wheat Research Institute, Shanxi Agricultural University, Linfen 041000, Shanxi, China

Arabinogalactan proteins (AGPs) perform crucial roles during cotton fiber development, and they are composed of a hydroxyproline (Hyp)-rich core protein and large type-II arabinogalactan (AG) moieties. AGPs are highly glycosylated proteins which involve two most important post-translational processes. First, the proline residues were hydroxylated by prolyl- 4-hydroxylases (P4Hs), then the Hyps were substituted with large arabinogalactan polysaccharides or small arabino- oligosaccharides by glycosyltransferases (GTs). Our previous work had shown that fiber elongation was repressed when-cultured cotton ovules were treated with inhibitors of P4Hs, suggesting that P4Hs were involved in cotton fiber development. In this study,was detected to be relatively highly expressed at fiber elongation stage. Overexpression and RNAi-silencing vectors ofwere constructed and transformed into cotton. Phenotypic analysis showed thatoverexpressing fibers were significantly shorter compared with the wild type from T1generation to T3generation. In addition, AGP content had increased inoverexpression fibers. Immuno dot-blot analysis also showed that carbohydrate moieties of AGP had changed. Moreover, RNA-seq revealed that expression levels of genes encoding hydroxyproline (Hyp)-rich glycoproteins including AGPs were enhanced. Overall, these results indicated thatmay regulate fiber development primarily through affecting AGPs composition.

cotton fiber; arabinogalactan proteins (AGPs); prolyl-4-hydroxylase (P4Hs)

10.3724/SP.J.1006.2021.04217

本研究由国家自然科学基金项目(31970516, 31671735)资助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31970516, 31671735).

许文亮, E-mail: wenliangxu@mail.ccnu.edu.cn

E-mail: 13613418576@163.com

2020-09-22;

2020-12-01;

2020-12-29.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20201228.1747.017.html