自身免疫性肝炎患者外周血中Linc00324的表达及临床意义

杨亚俊 史 英 杜成锋

1.陕西中医药大学第二附属医院检验科 (陕西 咸阳， 712000) 2.陕西中医药大学第二附属医院消化科 3.陕西榆林市星元医院检验科

自身免疫性肝炎是以免疫介导的肝脏病理损伤和肝功能异常为主要表现的慢性肝病，发病机制尚未完全明确，与遗传易感性、免疫调节异常及环境因素有关[1-4]。临床上主要通过临床表现、血液生化指标检测，必要时辅以病理检测进行确诊，但检测耗时繁琐，影响患者及时判断病情，因此寻求自身免疫性肝炎特异性指标有助于临床确诊。lincRNA在固有免疫及获得性免疫中发挥重要作用[5]，Linc00324是近年来研究较为广泛的lincRNA。本研究前期发现Linc00324在自身免疫性肝炎患者外周血白细胞中表达较高，尤其在CD4细胞中明显上调，猜测Linc00324可能参与自身免疫性肝炎的免疫调控。因此本研究重点探讨Linc00324在自身免疫性肝炎患者中的表达异常，为临床确诊提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年9月至2019年6月本院消化内科经临床确诊的自身免疫性肝炎患者55例为自身免疫性肝炎组，男26例，女29例；年龄30～60岁，平均(43.15±5.26)岁。患者均符合自身免疫性肺炎诊断标准[6]，均未接受治疗，排除遗传性疾病者、合并感染性疾病者、药物性肝损伤、酒精性肝损伤、合并恶性肿瘤及其他自身免疫性肝病者。另取同时期体检健康者61例为正常组，男28例，女33例；年龄30～60岁，平均(43.24±5.10)岁，既往无自身免疫性疾病病史。

1.2 实验方法

1.2.1 标本收集 抽取所有受试者空腹静脉血5 ml，分成两管，其中一管-80℃保存；另一管3 000 r/min，-4℃冷冻离心10 min，分离得上清液，-80℃保存。

1.2.2 实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)法检测血清Linc00324表达水平 按照Trizol试剂盒操作说明提取血清标本中总RNA，并通过反转录酶试剂盒Superscript Ⅲ将RNA反转录合成cDNA。采用Real Master Mix试剂盒并利用SYBR Green Ⅰ染料进行实时荧光定量PCR检测Linc00324表达水平，PCR反应条件：95℃ 10 min、(95℃ 15 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s)×40个循环。采用2-ΔΔCt算法计算Linc00324相对表达量。以GAPDH为内参基因，其引物序列：正向5′-GGGAAUAGUAGCUGUCAAATT-3′，反向5′-UUUGACAGCUACUAUUCCCTT-3′；Linc00324引物序列：正向5′-ACTCTACCTACATCTGGGACACT-3′，反向5′-GTAGGTCCCATGGTCATCCAG-3′。试验重复3次，取平均值。

1.2.3 生化、免疫指标检测 收集患者入院时肝功能检测指标，包括谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TBil)、碱性磷酸酶(ALP)，谷氨酰转肽酶(GGT)。免疫指标包括抗核抗体(ANA)、抗平滑肌抗体(SMA)、抗线粒体抗体(AMA)、免疫球蛋白G(IgG)，由检验科生化、免疫室检测。

1.2.4 免疫细胞测定 取外周血标本，EDTA抗凝后加PE标记的鼠抗人CD4+抗体，FITC标记的鼠抗人CD8+抗体各20 μl，涡旋振荡器混匀，于室温下避光反应15 min，加入溶血素1 ml，室温避光20 min，加入PBS缓冲液2 ml，离心，弃上清，加入1%多聚甲醛500 μl重悬细胞，上机检测CD4+、CD8+T细胞的比率。上机前常规对流式细胞仪进行检测，控制仪器各项指标在质控允许值内。上机检测时首先按照前向散射(FSC)和侧向角散射(SSC)光信号予淋巴细胞群设门，每份检测标本获取设门内10 000个细胞，检测后所得数据以Listmode文件保存。以CD4+/CD8+细胞比例作为Th/Ts细胞比例。

2 结果

2.1 两组受试者血清Linc00324表达及IgG水平情况 见表1。

表1 两组受试者血清Linc00324表达及IgG水平情况

2.2 两组受试者自身抗体阳性率比较 自身免疫性肝炎组ANA阳性率为89.09%(49/55)，SMA阳性率为18.18%(10/55)，AMA阳性率为0。正常组均未发现ANA、SMA、AMA阳性。ANA阳性(>1∶40)，SMA阳性(>1∶40)，AMA阳性(>1∶100)。

2.3 自身免疫性肝炎患者及正常者肝功能指标比较 与正常组相比，自身免疫性肝炎患者血清ALT、AST、TBil、ALP、GGT水平均显著升高(P<0.05)，见表2。

2.4 两组受试者免疫细胞水平比较 与正常组相比，自身免疫性肝炎组患者Th细胞比例、Th/Ts比值显著升高(P<0.05)，Ts细胞比例显著降低(P<0.05)，见表3。

2.5 自身免疫性肝炎患者血清Linc00324水平与各指标相关性 自身免疫性肝炎患者血清Linc00324水平与ALT、AST、ALP、IgG、Th、Th/Ts正相关(P<0.05)，与Ts负相关(P<0.05)，与TBil、GGT无相关性(P>0.05)，见表4。

表2 两组受试者肝功能指标比较

表3 两组受试者免疫细胞水平比较

表4 自身免疫性肝炎患者血清Linc00324水平与各指标相关性

2.6 血清Linc00324水平对自身免疫性肝炎的诊断作用 ROC曲线显示，血清Linc00324水平诊断自身免疫性肝炎的曲线下面积为0.795，截断值为2.031，敏感度为78.2 %，特异度为81.3 %，见图1。

图1 血清Linc00324水平对自身免疫性肝炎的诊断ROC曲线

3 讨论

自身免疫性肝炎是自身免疫性肝病中最常见的类型，其性别、年龄分布与红斑狼疮类似，其发病与自身免疫功能失调密切相关[7]。随着医学进展，人们对自身免疫性肝炎研究更加深入。研究显示，自身免疫性肝炎患者血清内出现大量自身抗体，提示自身抗体的升高促进自身免疫性肝炎的发生[8]。探索加速自身免疫性肝炎发展的因素，可为判断自身免疫性肝炎的发生及延缓疾病进程提供理论依据。

LincRNA本身不可被翻译为蛋白质，结构与mRNA类似，在染色体沉默、染色质修饰、转录激活等多种生物学过程中存在调控作用，LincRNA对获得性免疫和固有免疫均有一定影响[9]。Yang等[10]研究显示，lincRNA MALAT-1在系统性红斑狼疮患者血清中高表达。Linc00324位于人17p13.1[11]。本研究中自身免疫性肝炎患者外周血血清Linc00324表达显著高于正常者，提示Linc00324可能参与自身免疫性肝炎的发病过程。

当某些特异性的抗原物质(病毒、细菌等)与人体组织具有类似的抗原结构时，天然免疫耐受状态被打破，发生针对自身肝组织抗原的免疫应答及异常反应，造成自身肝组织损伤和炎症，引发自身免疫性肝炎[12]。研究显示，免疫调节失衡是引起自身免疫性肝炎的原因之一，当Ts细胞功能过低或Th细胞过度时，会导致自身抗体的产生[13]。Stashenko等[14]研究显示，Sprague-Dawley大鼠中随着鼠龄的增长Ts细胞明显减少，而Ts细胞功能的过早降低，可导致过量自身抗体出现，诱发与人类系统性红斑狼疮类似的自身免疫性疾病。本研究中，自身免疫性肝炎患者较健康者Th/Ts细胞比例上升，提示Th/Ts比例失衡可能参与自身免疫性肝炎病变过程。

自身免疫性肝炎患者肝功能严重受损，以血清AST、ALT水平升高为主要特征[15]。本研究中自身免疫性肝炎患者肝功能指标血清AST、ALT、TBil、ALP、GGT水平显著高于正常人，提示患者肝功能受损严重。自身抗体表现异常在自身免疫性肝炎中较为常见。Wang等[16]研究显示，几乎所有自身免疫性肝炎患者均有一种或多种自身抗体明显升高，多数患者为ANA或SMA阳性，偶尔可见抗线粒体抗体阳性。本研究55例自身免疫性肝炎患者中ANA阳性49例(89.09%)，SMA阳性10例(18.18%)，提示自身免疫性肝炎患者最常见的自身抗体为ANA和SMA，未见AMA阳性，可能是研究样本量较少。AMA和SMA均非自身免疫性肝炎的特异性指标，在原发性胆汁性胆管炎、脂肪肝及其他自身免疫性疾病中也存在AMA和SMA抗体阳性，临床诊断需结合其他检查。此外Pearson分析显示自身免疫性肝炎患者血清Linc00324水平与AST、ALT、ALP、IgG及Th/Ts均存在相关性，提示血清Linc00324水平与疾病活动密切相关，猜测Linc00324可能通过影响免疫系统平衡参与自身免疫性肝炎发生，具体机制有待进一步研究。进一步ROC分析显示血清Linc00324水平对诊断自身免疫性肝炎的曲线下面积为0.795，特异度与敏感度分别为81.3%,78.2%，提示血清Linc00324可能能作为诊断自身免疫性肝炎的生物学指标，截断值为2.031，表明Linc00324水平高于2.031者发生自身免疫性肝炎的风险高，为临床及科研人员对自身免疫性肝炎研究及治疗提供了靶点。

综上所述，自身免疫性肝炎患者血清Linc00324高表达，与临床肝功能指标、免疫细胞水平密切相关，可能成为自身免疫性肝炎的诊断标志物。但本研究也存在一定不足，选取样本量较少，需进一步扩大样本。