离析法在观察含笑属植物叶片气孔结构中的应用

焦亚冰，高志鹏，王容

（南京林业大学生物与环境学院，江苏 南京210037）

叶片是植物进行光合作用、蒸腾作用和维持自身系统平衡的重要器官。叶片性状是植物功能性状中一个重要的部分，关系着植物生物量的积累及对外界资源的获取和利用。气孔性状是叶片结构性状之一，而叶片结构性状在很大程度上影响植物的光合生理，进而影响植物的生长状况。有研究显示，气孔保证了植物在不断更新变换的的环境中持有一定的含水量。近年来，许多学者通过对气孔性状特征的研究发现，气孔在古植物学、地质学和法庭科学物证鉴定等方面都具有重大的研究价值。因此，植物叶片气孔观察方法的研究对于深入了解气孔性状是一项重要的工作。

植物叶片气孔的观察方法主要包括：撕取法、刮制法、印迹法、离析法和电镜扫描法五种。采用撕取法、刮制法、印迹法和电镜扫描法等方法观察气孔，会存在不同程度的效率低下、程序复杂繁琐、观察仪器设备要求高或操作难度大等问题。而离析法的主要原理是利用化学试剂把细胞与细胞间的中层物质溶解，使细胞分离，从而研究细胞的立体形态结构。选用离析法观察，制片容易、成功率高、表皮上无残留叶肉，观察到的气孔形态真实清晰。

本文以阔瓣含笑（

Michelia cavaleriei

var.

platypetala

）、含 笑（

Michelia figo

）、金 叶 含 笑（

Michelia foveolata

）和深山含笑（

Michelia maudiae

）为试验材料，详细介绍了使用离析法观察含笑属植物叶片气孔的试验操作步骤，以期为科研人员进行气孔观察和研究提供具体的方法指导。

1 材料与用具

1.1 植物材料

植物材料为含笑属阔瓣含笑、含笑、金叶含笑和深山含笑叶片。

1.2 试验用具

生物显微镜（Leica DM 2500，徕卡显微系统上海有限公司，中国上海）、标准级显微镜载玻片（45°角，抛光边，单头单面蒙砂，25 mm×75 mm，1～1.2 mm）、免洗盖玻片（24 mm×60 mm，0.13～0.16 mm，世泰)、烧杯（250 mL，直径70 mm；10 mL，直径26 mm）、广口瓶（1 000 mL，直径219 mm)、镊子、短粗玻璃刻度吸管（10 mL）、塑料滴管（3 mL）、剪刀、培养皿（直径75 mm，高度15 mm）、吸水纸、保鲜膜、一次性口罩、一次性乳胶手套、烘箱（XMTD-8222，上海精宏实验设备有限公司，中国上海）、高枝剪（ARS 180ZR-3.0-5，日本ARS产品专卖店，中国上海）、自封袋（PE塑料，28 cm×20 cm）。

1.3 试验药品

甲醛（广东光华科技股份有限公司，广东金华）、冰醋酸（上海申博化工有限公司，中国上海）、硝酸（南京化学试剂有限公司，江苏南京）、三氧化铬（国药集团化学试剂有限公司，中国上海）、番红溶液、无水乙醇。

2 试验溶液配制

70%F.A.A.固定液（配方：甲醛5 mL+冰醋酸5 mL+70%乙醇90 mL)

10%铬酸液（配方：10 g三氧化铬+100 mL蒸馏水）

硝酸—铬酸离析液（配方：10%硝酸液和10%铬酸液等比例混合配制）

1%番红溶液（配方：番红1 g+100 mL蒸馏水）

3 试验操作步骤

3.1 材料采集

2020年9月4日在南京林业大学校园内（118°80′E，32°08′N）阔瓣含笑、含笑、金叶含笑和深山含笑成熟林分中各选取1株，利用高枝剪在树冠中层外围东、南、西、北四个方向采摘叶片25片（一般选用植株上有代表性、健康无虫害、新鲜完好的叶片），每株100片，采集的叶片用自封袋封装。如果取材距离较远，可将叶子放在湿报纸里保存带回。

将采摘的4种含笑属植物叶片分别清洗干净，用吸水纸拭去叶片上的水，使叶片保持干净整洁平整，剪去叶柄，保留叶片中间1/3部分。剪裁叶片时用力均匀，避免组织破裂。

3.2 固定

将预处理过的干净叶片放入有F.A.A.固定液的广口瓶中静置48 h，固定液要完全浸没叶片。一般固定液的用量要达到叶片体积的20倍以上，否则叶片中的水分会稀释固定液的浓度，从而影响叶片材料的固定效果，无法达到试验预期效果。

3.3 冲洗

48 h后，先用镊子取出固定后的叶片，再用蒸馏水冲洗干净。冲洗的主要作用是让蒸馏水渗透到叶片中，彻底把固定液替换出来。

3.4 解离

选取要观察的部位，将清洗干净的叶片剪成0.5 cm×0.5 cm的片状，放入10 mL的烧杯中，倒入硝酸—铬酸离析液（注意离析液需浸没叶片），再用保鲜膜将烧杯口密封，放入烘箱在60℃条件下离析，叶片的离析程度以镊子轻轻夹即完全散开为宜。阔瓣含笑、含笑、金叶含笑和深山含笑的离析时长分别为1 h、0.5 h、2 h和1.5 h。

3.5 再次冲洗

取出离析好的叶片，再用蒸馏水多次反复冲洗，直至没有任何颜色为止。

3.6 染色

将叶片放入有番红溶液的培养皿中染色30 s，用镊子取出放入蒸馏水中清洗。

需要注意的是，配制好的番红溶液会有一些不溶解的杂质和颗粒，使用前需经过仔细过滤；放置时间过长的番红溶液会产生沉淀，使用前也需仔细过滤。

3.7 制片

将载玻片和盖玻片擦净，用滴管将水滴在载玻片的中央，再用镊子将染色后的叶片放于载玻片的水滴上，叶片表皮要铺平且完全展开。随后用镊子夹住盖玻片，使盖玻片边缘与材料左边水滴的边缘接触，向下放平盖玻片，用吸水纸拭去边缘的水珠。注意，加盖玻片时尽量避免产生气泡，如果出现气泡，需重新制作切片或者从盖玻片的一侧滴清水将气泡驱走。

3.8 镜检

首先，移动旋转器使低倍镜对准载物台的通光孔；其次，将制成的临时装片放在载物台上，用弹簧推片夹夹住；第三，观察时先用低倍镜观察找到物象，再用高倍镜进行观察。

低倍镜使用说明：先转动粗准焦螺旋，使载物台缓慢上升或下降，在增大工作距离过程中来调节焦距、寻找物象；再使用细准焦螺旋将叶片表皮的物象调至清晰为止，即可进行气孔特征的观察。

高倍镜使用说明：先在低倍镜下把需要进一步观察的部位调到中心，同时把物象调节到最清晰的程度以后，再转换到高倍镜下观察。在转换镜头至高倍镜时，需要观察镜头工作距离，如果过小，可能压碎玻片或损坏镜头，可提前顺时针转动粗准焦螺旋使载物台下降。

3.9 拍照

使用连接生物显微镜的电脑上的LAS X.lnx软件（Win7操作系统）进行拍摄保存（见图1）。

图14 种含笑属植物叶片上下表皮气孔结构的示例（10×）（1 242μm×932μm）

4 结论与讨论

（1）离析法主要是使用化学试剂将叶片上下表皮分离成透明状态，采用F.A.A.固定液可以保存气孔形态的完整性。离析法观察到的含笑属的气孔形态清晰，便于统计气孔数目、气孔开度、气孔长宽和气孔密度等指标。而且离析法不仅适用于叶片气孔观察，还可适用于导管筛管、叶脉脉序和表皮结构等形态特征观察。

（2）如图1所示，含笑属植物的气孔器是由两个肾形的保卫细胞和孔道组成的，形态呈椭圆形，分散在表皮细胞之间，无明显规律分布。含笑属植物叶片下表皮分布图中，叶脉存在的地方是没有气孔的存在。试验过程中，我们发现含笑和金叶含笑单位面积上气孔数目远不如阔瓣含笑和深山含笑数目多，这可能与它们的生长环境有关。Peat等1994年的研究表明，气孔的分布和密度可能受遮阴环境、叶面积大小、叶轮廓、叶片是否有毛、叶片角度和其他生态条件（如海拔）等因素的影响。

（3）在自然界中，不同植物的气孔数目和分布是不同的，有些植物的气孔全分布在上表皮或下表皮，也有些植物上下表皮都有气孔的分布或都没有气孔的分布。大多植物的叶片气孔分布是下表皮多于上表皮的，特别有些木本植物，只在下表皮才有气孔的分布。在阔瓣含笑、深山含笑、含笑和金叶含笑4种含笑属植物叶片上表皮没有气孔的存在，气孔只分布于下表皮，这是为了叶片可以更好进行光合作用和蒸腾作用。因此，在进行含笑属植物叶片气孔性状研究时，可直接选取下表皮气孔作为分析研究的对象。

（4）使用离析法的关键是使叶片表皮变透明，这也是为什么不同的材料要考虑不同的离析时长。根据包淑云等研究结果可知，阔瓣含笑、深山含笑、含笑和金叶含笑的叶片厚度、角质层厚度、栅栏组织厚度和海绵组织的厚度有明显的不同。其中，叶片厚度从大到小顺序依次为：金叶含笑、深山含笑、含笑、阔瓣含笑；角质层厚度从大到小顺序依次为：金叶含笑、阔瓣含笑、深山含笑、含笑；栅栏组织厚度/海绵组织厚度比从大到小顺序依次为：阔瓣含笑、深山含笑、金叶含笑、含笑。因此，4种试验材料的离析时间不同。

（致谢：本文在写作过程中受到南京林业大学竹类研究所副教授时培建老师的学术指导，特此表示感谢！）