盐肤木叶药用成分影响因素的研究

胡克特，张 萍，陈荣祥,3，顾 丁

(1.遵义医科大学 基础医学院,贵州 遵义 563099；2遵义医科大学附属第三医院,贵州 遵义 563000；3遵义市理化分析测试工程技术研究中心，贵州 遵义 563000)

盐肤木(RhuschinensisMills)为漆树科盐肤木属(Rhus)落叶小乔木，是我国重要的林业经济植物[1]，其茎和根常用于制作中药[2-3]，盐肤木叶具有化痰止咳，收敛，刺激血液循环等功效[4-6]；我国重要的中药材五倍子是由瘿绵蚜科某些昆虫寄生于几种盐肤木属植物复叶上而形成的瘿瘤[7]。五倍子所含酚类化合物是一种具有诸多用途的天然产物，常被用作医疗与化工原料[8-10]，具有抗炎、抗辐射、抗肿瘤等生物活性[11-13]，例如，其中的没食子酸具有改善脑缺血再灌注损伤，改善心衰的心功能障碍和纤维化的功能[14-15]。目前，五倍子多酚获取途径比较单一，即主要依赖五倍子进行提取；然而，近年来，由于生态环境遭到破坏，导致自然生长的虫瘿越来越少，从而使五倍子的产量逐年降低，进而无法满足相应的市场需求[16]。较五倍子而言，盐肤木叶片的资源相对丰富且易于获得，并且研究发现其中含有一定量的五倍子多酚类物质，但其含量远小于五倍子[17-19]。尽管如此，若能充分利用盐肤木叶片提取酚类物质，或为解决五倍子短缺的问题提供了一种可能的途径。因此，为了解盐肤木叶片药用成分的积累特征，本研究测定了自然条件下生长的盐肤木叶片的总酚含量及其它药用成分的含量，以期确定其最佳采摘时节和叶龄。同时，本研究还对其提取工艺进行了优化。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 Lambda265 紫外可见分光光度仪(铂金埃尔默仪器有限公司)；GZX-9070MBE电热鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；UltiMate 3000 Bio—RS型超高效液相色谱仪(赛默飞世尔科技有限公司)；ME104/2万分之一电子天平(梅特勒-托利多)；Chorus纯水及超纯水系统(英国埃尔格)；5B—5200DT超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

福林酚(Folin，CAS:12111-13-6，飞净生物科技有限公司)；甲醇、乙腈、柠檬酸(色谱纯，阿拉丁生化科技股份有限公司)；没食子酸、没食子酸甲酯、表没食子儿茶素没食子酸酯、没食子酸乙酯、表儿茶素没食子酸酯、根皮苷标准品(阿拉丁生化科技股份有限公司)。

1.2 植物材料与实验方法

1.2.1 植物材料及其处理 供试植物，选取位于贵州省遵义市(北纬N27°43′24.19″，东经E107°04′24.08)的野生盐肤木。

于2019年5月中旬到9月中旬，测定3株盐肤木的叶片的总酚变化情况；3株树龄在3年以上，每月每株树上随机选择3根树枝采摘3组叶片，每组采20片叶片；共测定45次总酚含量。采摘叶片时，选取完整的和无病虫害的叶片。

于2020年6月8日采摘12株树叶片，其中9株，树龄为3年期，另3株为1年期。每株树取1整条枝的叶，枝条末端1/3为新生嫩叶片，中部1/3为中等嫩叶片，下部1/3为较老叶片；每组10片叶片，测量多酚、类黄酮、总酚含量，共测量36次。所采摘的叶片均先放入120℃烘箱内进行杀青15～20 min，然后于60℃烘箱内烘干，粉碎，过80目筛，备用。

1.2.2 多酚提取 精确称取0.1 g盐肤木叶片粉末，采用80%甲醇溶液超声提取多酚。提取条件：料液比1∶100(g/mL)，在16 ℃水中，超声提取50 min，冷却，取1 mL于EP管中在12 000 r/min离心10 min，取上清，然后0.22 μm滤膜过滤。

1.2.3 条件优化 在不同提取条件下，对同一份盐肤木叶的总酚进行提取，并对其含量进行测定；提取时，超声温度均为16 ℃，其余试验因素设置见表1。

表1 单因素试验表

1.2.4 标准溶液配制 取没食子酸、没食子酸甲酯、表没食子儿茶素没食子酸酯、没食子酸乙酯、表儿茶素没食子酸酯、根皮苷标准品并配成浓度为1 000 mg/L的混合标准品溶液，再将其梯度稀释成浓度为10、20、50、80、100 mg/L的混合标准品溶液。

1.2.5 总酚测定 提取方法采用1.2.2的方法，稀释10倍，采用福林法[20]，取样品液0.5 mL，加入0.25 mol/L 福林酚试剂0.5 mL，混合，静置3 min，再加入15% Na2CO31 mL混合，静置30 min，12 000 r/min离心10 min，取上清，以未加样品的对照组为空白，测定760 nm吸光度。

1.2.6 多酚及类黄酮测定 采用色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1 mm × 100 mm ,1.8 μm)；流动相条件：50 mmol/L柠檬酸盐溶液(pH 2.9)与甲醇，按以下梯度洗脱：0～14.5 min，10%～35%柠檬酸盐溶液; 之后采用40% 柠檬酸盐冲洗2 min后回到初始梯度并平衡4 min，柱温30℃，进样体积1 μL。DAD检测波长275 nm。

2 结果

2.1 总酚提取条件的优化

2.1.1 料液比优化 由图1可知，盐肤木叶总酚的获取率随着料液比的增加而提高，但当料液比超过1∶50(g/mL)时，总酚提取率趋于稳定，这可能是因为样品所含总酚全部溶于甲醇溶液后，总酚提取率便不再随甲醇溶剂量的增加而提高。由于1∶100(g/mL)获取率最高，在之后测定中仅用稀释一次，故选取1∶100(g/mL)为最佳料液比。

图1 不同料液比下盐肤木样品中总酚的获取率变化趋势

2.1.2 超声时间优化 由图2可见，总酚提取率随超声时间的增加而升高，当单次超声时间为50 min时，总酚提取率达到峰值；之后，总酚提取率便不再随着超声时间延长而升高，可能因为是由于超声波的击碎和热效应导致某些多酚成分分解[21]。因此，超声提取时间可定为50 min。

图2 不同超声时间下盐肤木样品中酚类化合物的变化趋势

2.1.3 甲醇体积分数的优化 由图3可见，总酚提取率随甲醇体积分数的增加而升高，当甲醇体积分数为80%时，总酚的提取率可达到最大；但当甲醇体积分数继续增加时，总酚获取率反而下降。因此，甲醇体积分数可选为80%。

图3 不同甲醇的体积分数下盐肤木样品中酚类化合物的变化趋势

综上所述，料液比1∶100(g/mL)，超声时间为50 min，甲醇体积分数为80%时，可得到最高的多酚获取率。

2.2 盐肤木叶片总酚含量随季节变化 由图4可见，3株3年期盐肤木叶片的总酚含量大致在3%～12%；从5月中旬至7月中旬盐肤木叶片的总酚含量呈上升趋势，并在7月达到峰值，之后，则呈下降趋势；盐肤木叶片的总酚含量在相同月份内无显著差异(P>0.05)，而不同月份间有显著差异(P<0.05)；这表明盐肤木叶片的总酚含量具有季节性变化。

图4 3年期盐肤木叶片总酚含量的变化

2.3 不同老嫩叶片化学成分的含量测定和分析 采用上述优化的提取条件对12株盐肤木的不同老嫩程度叶片的成分进行提取，并采用液相色谱对提取物进行检测，探究老嫩影响时3年期，1年期均在一起统计，探究树龄影响时，将不同树龄的盐肤木叶进行分开统计，结果见表2。

表2 12株盐肤木样品中化合物含量测定结果 (mg/g)

由表2可见，盐肤木嫩叶与老叶的总酚无显著差异(LSD检验，P>0.05)；由图5可知，盐肤木叶共鉴定出6种化合物，其中表没食子儿茶素没食子酸酯在盐肤木嫩叶片分别与中等嫩叶片和老叶片具有显著差异(P<0.05)，表儿茶素没食子酸酯在盐肤木嫩叶片和老叶片具有显著差异(P<0.05)，根皮苷在盐肤木嫩叶片和老叶片，中等嫩叶片和老叶片具有显著差异(P<0.05)，其余成分均无显著差异(P>0.05)。此外，在本研究中，总酚在3年以上的盐肤木树的叶片与1年左右的树的叶片之间不存在显著差异(t检验，P>0.05)，而没食子乙酯、根皮苷存在显著差异(P<0.05)，表明盐肤木叶片总酚受树龄影响较小，没食子乙酯，根皮苷受树龄影响较大，3年期以上盐肤木叶较1年期盐肤木叶根皮苷含量较多，而没食子乙酯含量较少。

A：标准品；B：样品；1：没食子酸；2：没食子酸甲酯；3：表没食子儿茶素没食子酸酯；4：没食子酸乙酯；5：表儿茶素没食子酸酯；6:根皮苷。

3 讨论

盐肤木叶总酚的提取工艺优化的实验结果表明，当提取溶液为80%甲醇时，料液比1∶100(g/mL)提取时间为50 min时，可获得的多酚最多；相较前人研究[17-19]，在盐肤木酚类提取时多采用乙醇提取，笔者在试验中发现甲醇对酚类化合物的提取能力要高于乙醇，但甲醇作为溶剂的不足之处是其毒性较乙醇大；前人多采用1∶40的料液比，通常情况下料液比中的“液”越多，提取效果越好，但常需考虑试剂的成本收益率和污染等因素，并且由于测量总酚试剂有效量程基本固定，过多过少的提取液都会使溶液浓度超出试剂有效量程，如果再度稀释或浓缩会增加试验操作难度，导致试验误差增大，所以在选择考虑料液比时应综合考虑各种因素。

在本研究中，所采摘的自然生长的盐肤木叶片总酚含量均低于13%，7月和8月的含量较高；从5月中旬至7月中旬盐肤木叶片的总酚含量不断增加，并在7月达到峰值，之后呈下降趋势；这表明，盐肤木叶片的总酚含量随着气温升高和光照增强而增加，这可能是因为单宁酸等酚类物质具有较强的吸水性和紫外光吸收能力，从而有利于提高植物的抗旱能力和抗紫外线能力[22]。从已有研究来看[23-24]，植物次生代谢物的累积多呈抛物线形，即从发芽起逐渐累积，达到一定峰值后便呈下降趋势。然而，在本研究中，与老叶相比，幼嫩叶片在某些成分(如，表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯和根皮苷)的积累上更具优势。而3年期对比1年期期盐肤木所产叶片其根皮苷含量更高，因而更具有潜在的开发利用价值，而没食子乙酯却在1年期盐肤木叶中含量更多，其原因值得进一步研究。总之，本研究表明盐肤木叶主要药用成分的含量受其采集时间、树龄、叶龄以及提取条件的影响，这可为盐肤木叶的进一步开发利用提供理论参考。