TOP2A基因改变和蛋白表达在浸润性乳腺癌中的临床意义

丁文双，刘国荣，李秀博,常丽君，严 青,杜 洪

(广州市第一人民医院暨华南理工大学附属第二医院 病理科，广东 广州 510045)

DNA拓扑异构酶IIα(Topoisomerase II-alpha，TOP2A)是DNA代谢过程的重要核酶，对应编码基因为TOP2A，其主要通过降低DNA超螺旋结构参与基因复制、细胞周期调控等功能。TOP2A蛋白在肿瘤组织中表达明显高于正常组织，因此TOP2A成为抗癌药物研发的重要靶点。TOP2A蛋白抑制剂代表药物有阿霉素、柔红霉素等蒽环类药[1-2]。蒽环类药物是浸润性乳腺癌术后辅助化疗的基础药物之一，然而不是所有乳腺癌患者均对蒽环类药物敏感，且该类化疗药物有明显的心脏毒性和诱发多种髓系肿瘤和急性白血病的毒副作用[3-5]。如何从乳腺癌患者中筛选出对蒽环类药物敏感的群体成为临床研究的热点，多个临床中心药物试验显示伴HER2和TOP2A共扩增的浸润性乳腺癌患者能从含蒽环类药物化疗方案中明显获益[6-8]。换言之，HER2和TOP2A共扩增是指导临床选择蒽环类化疗药的敏感指标。

目前检测TOP2A基因扩增主要依靠荧光原位杂交(FISH)，鉴于FISH检测成本和技术普及问题，本研究用更普及的免疫组化法(IHC)检测TOP2A蛋白表达，通过分析TOP2A蛋白表达与TOP2A基因改变的一致性，探讨IHC法检测TOP2A表达在初筛HER2和TOP2A共扩增乳腺癌病人中的价值。同时本实验还对TOP2A蛋白表达与浸润性乳腺癌相关临床病理参数之间的关系进行回顾性研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集我院病理科2018年1月至2020年8月检测的浸润性乳腺癌177例，其中导管内癌不纳入该研究，回顾性分析每例浸润性乳腺癌相关临床病理特征包括年龄、肿瘤分级、病理组织学分级、临床分期、淋巴结转移、ER、PR表达、HER2状态及Ki-67增殖指数。本组病例发病年龄28～92岁(中位年龄54岁)，按2011 St Gallen改良基于免疫组化的分子分型：Luminal A型59例(33%，59/177)，Luminal B型77例(44%，77/177)，HRE2阳性型22例(12%，22/177)，三阴型19例(11%，19/177)。HRE2扩增38例(21.5%，38/177)，HRE2无扩增139例(78.5%，139/177)。

1.2TOP2A荧光原位杂交及判读标准 标本经4%中性甲醛液固定，石蜡包埋切片(厚度=3 μm)经脱蜡、水化后滴加80 μL胃蛋白酶(广州安必平)，37 ℃孵育消化20 min；70%、95%及100%梯度酒精脱水；加探针(TOP2A，广州安必平)50 μL，加盖玻片入杂交仪变性5 min，37 ℃杂交过夜；洗脱盖片，干燥后滴加10μL DAPI，荧光显微镜下观察计数。TOP2A判读标准：TOP2A/GEP17信号比>2为扩增，TOP2A/GEP17信号比<0.8为缺失[9]。

1.3 TOP2A免疫组织化学染色及判读标准 标本经4%中性甲醛液固定，石蜡包埋切片(厚度=3 μm)常规脱蜡水化，免疫组织化学染色均采用Leica全自动免疫组化染色机(设备型号：BenchMark ULTRA型)，TOP2A抗体(广州安必平，即用型，克隆号：MyR1)。由于TOP2A蛋白表达半定量分析无统一参考标准，本研究从着色强度和阳性细胞比例两方面共同评价TOP2A蛋白表达：依着色强度弱-强分别标记为+-+++，对应分值分别为1、2、3分；随机选取10个浸润性癌高倍镜视野(400倍)，记录阳性细胞数占肿瘤细胞总数比例，0%～25%、26%～50%、51%～75%，76%～100%对应分值分别为1、2、3、4；总分值=着色强度×阳性细胞比例，其中1～6分为TOP2A蛋白低表达，7～12分为TOP2A蛋白高表达。

1.4 统计学分析 数据均采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，TOP2A基因与TOP2A蛋白表达一致性检验采用Kappa检验，TOP2A蛋白表达在浸润性乳腺癌各临床病理参数中的表达差异采用卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1TOP2A荧光原位杂交结果TOP2A基因改变共28例(14.1%，28/177)，其中TOP2A基因扩增22例(10.7%)，TOP2A基因缺失6例(3.4%)。TOP2A基因改变(包括扩增或缺失)主要发生于HRE2扩增组(63.2%，24/38)，差异有明显统计学意义(P<0.01，见表1)。其中HER2和TOP2A共扩增19例(50%，19/38，见图1A、B)。

表1 TOP2A基因改变与HER2基因改变关系

2.2 TOP2A免疫组织化学染色结果 80例可继续研究组织行TOP2A免疫组化检测，TOP2A蛋白阳性信号定位于细胞核，着色为棕黄色。按着色强度分为“+-+++”三级，其中“+”着色共21例(26.3%，21/80)，“++”着色共38例(47.5%，38/80)，“+++”着色共21例(26.3%，21/80)；TOP2A阳性细胞表达比例5%～100%不等，其中表达比例0%～25%共31例(38.8%，31/80)，26%～50%共17例(21.3%，17/80)，51%～75%共15例(18.8%，15/80)，76%～100%共17例(21.3%，17/80)；TOP2A蛋白高表达25例(31.3%，25/80)，TOP2A蛋白低表达55例(68.7%，55/80)，见图1C、D。

A：HER2扩增，HER2探针红色，GEP17青色，红色信号成簇状扩增(FISH × 1000)；B：TOP2A扩增，TOP2A探针绿色，GEP17青色，TOP2A/GEP>2(FISH × 1000)；C：TOP2A蛋白高表达，棕黄色强信号定位于细胞核，阳性细胞比例80%(IHC × 200)；D：TOP2A蛋白低表达，棕黄色中等信号定位细胞核，阳性细胞比例20%(IHC × 200)。

2.3 TOP2A蛋白表达与TOP2A基因改变一致性结果 免疫组化显示共25例TOP2A蛋白高表达，其中16例FISH结果为扩增。两种不同实验方法的一致性Kappa值为0.536(见表2 ,P<0.05)。

表2 TOP2A蛋白表达与TOP2A基因改变一致性结果

2.4 TOP2A蛋白表达与浸润性乳腺癌相关临床病理特征关系 TOP2A蛋白高表达率在HRE2扩增组为56.3%(P<0.01)，在HRE2和TOP2A共扩增组为84.2%(P<0.01)，TOP2A蛋白表达在不同年龄、肿瘤T分期、组织学分级、淋巴结状态、分子分型、ER、PR组间差异无明显统计学意义(见表3)。

表3 TOP2A蛋白表达与临床病理特征相关性

3 讨论

乳腺癌是危及全球女性健康最常见肿瘤之一。2011年St Gallen国际乳腺癌会议时专家组提出了基于免疫组化检测ER、PR、HER2及Ki-67表达的乳腺癌分子改良分型系统，各分子亚型对应不同的临床治疗策略[10]。蒽环类药物是TOP2A蛋白的活性抑制剂，TOP2A与HER2毗邻位于17号染色体长臂，两者的基因改变具有一定协同性，学者们推测伴HER2扩增的乳腺癌患者能从蒽环类化疗方案中获益与HER2和TOP2A基因共扩增有关，该结论在后续的多个临床药物试验或临床数据荟萃分析中得到证实[6,11-12]。病理诊断工作中筛选HER2和TOP2A基因共扩增乳腺癌亚群具有重要的临床意义，依据此分子改变可优化乳腺癌患者的化疗方案，对不必应用蒽环类化疗药物的患者，可避免应用蒽环类药物而产生严重的细胞毒性反应。

FISH是检测HER2和TOP2A基因扩增的可靠手段之一。本研究中利用该方法检测HER2和TOP2A基因共扩增比例为50%，文献报道HER2和TOP2A基因共扩增比例约30%～50%，本研究数据与文献报道一致。同时本研究中数据发现HER2正常组中3例伴TOP2A扩增，文献报道HER2正常组通常不伴有TOP2A扩增[6-7]，该差异可能因TOP2A扩增判读标准差异或不同厂家探针引起。Varga等报道不同生产厂商探针检测同一批病例TOP2A扩增结果不一致(36% vs 26%)，HER2基因与TOP2A基因位置毗邻，TOP2A基因探针覆盖目标基因片段过长可同时覆盖到HER2基因，对HER2基因扩增而TOP2A基因无扩增病例造成假阳性判断[9]。针对TOP2A扩增而HER2正常的病例，建议更换不同厂家探针进行验证。

鉴于FISH检测成本和技术普及问题，本实验利用更为普及的免疫组化法检测TOP2A蛋白表达，探讨TOP2A蛋白表达在初筛HER2和TOP2A共扩增病人中的价值。结果显示两种不同检测手段检测TOP2A表达有中度相关性(Kappa值0.536)，由于本研究中TOP2A蛋白高表达病例较少，两者一致性评价需积累更多病例进一步证实。本研究的结论与部分文献报道数据有一定差异，如Varga等研究发现TOP2A蛋白表达与TOP2A基因扩增无明显一致性，作者用免疫组化方法检测TOP2A蛋白表达发现9.5%(4/42)样本阳性信号<10%，而90.5%(38/42)样本信号>10%(平均50%～80%)，该差异与判定TOP2A蛋白表达的标准不同有关[9]。

本研究首次从着色强度和阳性细胞占比两方面半定量分析TOP2A蛋白表达，TOP2A蛋白高表达在HER2和TOP2A共扩增组中比例为84.2%，该结果提示从着色强度和阳性细胞占比两方面半定量评价TOP2A蛋白表达可一定程度预测TOP2A和HER2共扩增状态。本实验另发现TOP2A基因无扩增组也存在部分TOP2A蛋白高表达病例(17%)，这表明TOP2A蛋白表达除了受TOP2A基因调控外，还会受其他转录因子或转录后调控[13]。国内外学者对TOP2A蛋白表达在浸润性乳腺癌中的意义进行探讨，O'Malley等对一组伴淋巴结转移的浸润性乳腺癌患者(n=477)TOP2A蛋白研究发现，TOP2A高表达组(阳性细胞比例>13%)可从含蒽环类化疗药物方案(环磷酰胺+表柔比星+五氟尿嘧啶，CEF)中明显获益，无病进展期和总体生存率均明显高于CMF化疗方案组，这提示TOP2A蛋白高表达可作为临床筛选含蒽环类化疗方案的标记物。国内刘丽娟等报道TOP2A蛋白表达与Ki-67增殖指数相关，且TOP2A蛋白高表达病人预后较差[14-15]。本研究发现Ki-67高增殖指数组TOP2A蛋白高表达率高于Ki-67低增殖指数组，但差异无明显统计学意义，TOP2A蛋白表达与其他相关临床病理特征无明显相关性。

综合所述，TOP2A蛋白可一定程度初筛TOP2A和HER2共扩增状态。建议诊断工作中常规开展TOP2A蛋白免疫组化检测，通过着色强度、比例两方面半定量评价TOP2A蛋白表达，对TOP2A高表达病例建议行TOP2A基因检测，以更好指导后续临床用药。