大黄酸对胰腺癌细胞增殖和迁移的影响及机制研究

胡立娟，王 丰

肿瘤细胞发生转移是其恶性度高的生物学标志之一，也是肿瘤患者治疗失败和死亡的主要因素[1]。肿瘤细胞间黏附作用的减弱、细胞外基质的结构改变、降解以及细胞的运动性、侵袭性增强等有助于肿瘤发生转移。上皮型钙黏附蛋白（E-cadherin）表达下调与上皮性肿瘤转移密切相关，已有研究证实锌指转录因子（Snail）可下调E-cadherin表达，促进癌细胞迁移[2]。胰腺癌早期即发生转移，对放化疗反应差，导致5年生存率低于10%[3-4]。缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）在包括胰腺癌在内的大多数肿瘤普遍表达，通过调控下游100多种靶基因转录，从增殖、侵袭和转移、能量代谢、血管生成等多方面影响肿瘤的发展进程[5-6]。最近研究还发现，HIF-1α可下调E-cadherin的表达，重塑细胞外基质及增强癌细胞侵袭性等机制促进胰腺癌的侵袭与转移[7]。

大黄酸是中药大黄的有效成分，具有抗炎、抗肿瘤等药理作用[8]。有研究发现大黄酸能通过抑制磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）和细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK） 信号通路，进而抑制乳腺癌细胞HIF-1α和血管内皮生长因子（vascular endothlial growth factor，VEGF）的表达[9]。本课题组前期研究也发现大黄酸能通过抑制胰腺癌细胞中HIF-1α表达进而改善荷瘤小鼠周身代谢紊乱[6,10]，但大黄酸能否通过抑制HIF-1α影响胰腺癌细胞的迁移尚不清楚。本研究以人胰腺癌MiaPaCa-2细胞为研究对象，观察大黄酸对胰腺癌细胞增殖和迁移的影响，并初步探索其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人胰腺癌细胞系MiaPaCa-2（#CC 2408）购自中国科学院上海细胞库。DMEM培养基和胰蛋白酶购自美国Gibco公司，胎牛血清（FBS）购自以色列Bioind公司，大黄酸购自美国Sigma公司。CCK8增殖毒性检测试剂盒购自北京碧云天公司。Transwell小室购自美国Millipore公司，结晶紫染色液购自北京索莱宝公司。HIF-1α抗体购自美国Novus公司，E-cadherin抗体和Snail抗体购自美国Abcam公司，β-actin抗体购自美国Sanata Cruz公司，偶联HRP的山羊抗兔抗体和山羊抗小鼠抗体购自上海良森生物科技有限公司，小鼠抗山羊抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。增强化学发光底物检测试剂盒购于美国Perkin Elmer公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将人胰腺癌MiaPaCa-2细胞用含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM高糖培养基，于37℃，5% CO2的培养箱中传代培养。

1.2.2 CCK8法检测大黄酸对MiaPaCa-2细胞增殖的影响 用0.25%胰酶将MiaPaCa-2细胞消化，制成细胞悬液，每孔5×103个细胞接种于96孔板，于37 ℃，5% CO2的培养箱中培养24 h。用无血清DMEM稀释大黄酸，使其终浓度分别为20、50、100、200 μmol/L，96孔板中每孔加入100 μL稀释后的大黄酸，每个浓度5个复孔，阴性对照组加入无血清的DMEM，于常氧（5% CO2、95%空气、37 ℃）条件下分别孵育24、48、72 h。每孔加入10 μL CCK8溶液，培养2 h后在酶标仪上于450 nm处测定各孔的光密度（OD）值。按以下公式计算细胞增殖抑制率：抑制率（%）=（1-实验孔OD值/对照孔OD值）×100%。

1.2.3 Transwell法检测大黄酸对MiaPaCa-2细胞迁移的影响 本实验所用Transwell小室孔膜直径选用的是8 μm。将MiaPaCa-2细胞用0.25%的胰蛋白酶消化，随后计数，在每个小室中分别加入5×104个细胞，体积为200 μL。与此同时在Transwell下室中加入含有10% FBS和100 nmol/L胰岛素的DMEM培养基。置于培养箱2 h后，在上室细胞中加入2 μmol/L和10 μmol/L的大黄酸，分别置于常氧和缺氧（1% O2、5% CO2、94% N2、37 ℃）条件下，16 h后取出小室做结晶紫染色。实验结束后将小室用PBS洗2遍，用棉签慢慢擦去上室内的细胞，将小室放在甲醇中固定15 min，取出小室在室温下翻转晾干，用0.1%的结晶紫染液染色10～20 min，PBS洗2遍。把小室底朝上，用正置显微镜进行观察和拍照。选取8个连续视野进行计数。将每个视野中迁移过来的细胞数取平均值，即为1次的实验结果。整个实验重复5次。

1.2.4 Western blot法检测大黄酸对HIF-1α、E-cadherin和Snail表达的影响 用不含血清的DMEM培养基配制大黄酸，使其终浓度分别为20、50、100、200 μmol/L，于常氧和缺氧条件下处理细胞6 h，裂解细胞，收集蛋白。取20 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，Western blot法检测HIF-1α、E-cadherin和Snail的表达。一抗孵育过夜，二抗孵育2 h，以β-actin作为内参，增强化学发光底物试剂盒检测曝光，应用NIH Image J 软件进行分析。

2 结果

2.1 大黄酸对MiaPaCa-2细胞增殖的抑制作用不同浓度的大黄酸均能有效抑制MiaPaCa-2细胞的增殖，且抑制作用随着大黄酸浓度的升高和作用时间的延长而增强，呈现出剂量依赖性和时间依赖性（P＜0.05），见表1。

表1 大黄酸对MiaPaCa-2细胞增殖抑制率的影响

2.2 大黄酸对MiaPaCa-2细胞迁移的影响 在常氧条件下，对照组细胞迁移的数目为（63.20±7.98）个，2 μmol/L大黄酸作用16 h后，迁移的细胞数目约为（35.40±5.59）个，10μmol/L大黄酸组迁移的细胞数目约为（15.20±1.92）个，与对照组相比，大黄酸组胰腺癌细胞迁移数目减少（P＜0.05）；在缺氧条件下，与对照组（69.60±9.61）个相比，2μmol/L大黄酸组和10μmol/L大黄酸组细胞迁移数目[分别为（33.80±7.26）个和（13.20±3.42）个]减少（P＜0.05）。说明大黄酸抑制胰腺癌细胞迁移，高浓度大黄酸组抑制细胞迁移的作用更明显，见图1。

图1 大黄酸对胰腺癌细胞迁移的影响

2.3 大黄酸对MiaPaCa-2 细胞HIF-1α、E-cadherin和Snail表达的影响 在常氧状态下，HIF-1α表达很低，缺氧条件下，HIF-1α表达明显升高，大黄酸抑制了缺氧条件下，HIF-1α的表达，且抑制作用随浓度升高而增强（P＜0.05）；在常氧和缺氧状态下，大黄酸均能抑制Snail的蛋白表达，促进E-cadherin的表达（P＜0.05），且具有剂量依赖性（图2）。

图2 大黄酸对HIF-1α、E-cadherin和Snail表达的影响

3 讨论

大黄酸具有抗肿瘤的生物学作用，可通过调节肿瘤细胞的增殖、血管生成、凋亡、能量代谢等多个生物学过程来控制肿瘤的发展进程[11]。有研究发现，大黄酸和表皮生长因子抑制剂联合应用可促进胰腺癌细胞凋亡[12]。我们之前的研究表明大黄酸能下调肿瘤的瓦博格效应，从而缓解荷瘤小鼠的周身代谢紊乱[6,10]。本研究结果显示大黄酸在体外能直接抑制胰腺癌细胞的增殖，并且随着浓度增加和作用时间的延长，其抑制作用更明显，说明大黄酸对胰腺癌细胞增殖的抑制作用具有剂量和时间依赖性。

原发性恶性肿瘤中HIF-1α表达升高，而转移性肿瘤中HIF-1α的表达更高，这提示HIF-1α在肿瘤的侵袭与转移方面起着非常重要的作用[13]。E-cadherin是一种钙依赖性细胞黏附分子，可介导细胞间的连接，其表达的缺失可使细胞之间的极性丢失，黏附能力下降。研究发现43%的人胰腺癌组织中E-cadherin的表达部分或完全缺失，其表达的减少或缺失与胰腺癌患者的预后不良相关[14]。Snail可以与E-cadherin启动子上的作用元件相结合而抑制E-cadherin的表达，促进细胞从原发部位脱落而迁移[15-16]。研究发现在低分化的人胰腺癌细胞株MiaPaCa-2和Panc-1中，Snail的表达明显高于分化程度高的细胞株AsPC-1，Snail在人胰腺癌组织中高表达，其表达程度与癌细胞的淋巴结和远处转移呈正相关[17]。还有研究发现，HIF-1α可通过上调Snail进而抑制E-cadherin的表达，从而促进胃癌的侵袭和转移[18]。大黄酸能否通过HIF-1α抑制胰腺癌的迁移尚不清楚。本研究在不影响胰腺癌细胞增殖的前提下，选用低浓度（2 μmol/L和10μmol/L）大黄酸观察其对胰腺癌细胞迁移的影响，结果显示在常氧和缺氧条件下大黄酸均能抑制胰腺癌细胞的迁移。同时Western blot结果显示大黄酸抑制了HIF-1α和Snail的表达，而上调了E-cadherin的表达，且随着大黄酸浓度增加，作用越明显，表明大黄酸通过抑制HIF-1α和Snail的表达，继而上调了E-cadherin的表达，抑制胰腺癌细胞迁移。

综上所述，大黄酸能抑制胰腺癌细胞的增殖和迁移，其作用机制可能是通过抑制HIF-1α实现的。深入阐明大黄酸抗胰腺癌的作用机制将有助于临床治疗肿瘤新药的研发。