肝细胞癌中组蛋白甲基化酶SET结构域分支型1的表达及其临床意义
2021-04-25马景涛艾力伊敏
杨 静,马景涛,艾力·伊敏,闫 骏
肝细胞癌为我国消化系统恶性肿瘤中的常见类型,属于原发性肝病范围,在原发性肝癌中占比90%左右[1],其死亡率相对较高,在现阶段全球范围内癌症相关死亡原因中占据第三位[2]。近年来,关于肝细胞癌发病机制的研究得到本领域专家的广泛关注,很多研究都在探索其分子发病机制[3]。肝细胞癌中组蛋白甲基化酶SET结构域分支型1(SETDB1)属于组蛋白赖氨酸N端甲基转移酶,其编码基因的位置为人类染色体1q21上。研究发现,在乳腺癌[4]、卵巢癌[5]患者中,SETDB1的表达水平较高时,可能会对肿瘤细胞迁移、增殖及侵袭过程发挥促进作用,因此,SETDB1可作为预测癌症患者预后的重要指标。目前,在肝细胞癌中研究SETDB1的表达情况较少见,本研究选取确诊的肝细胞癌患者,选取其癌组织和癌旁组织,展开对比分析,了解肝细胞癌中SETDB1的表达情况,现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选取2019年3月—2020年6月天津市第一中心医院收治的90例肝细胞癌患者,其中男78例,女12例,年龄41~82岁,平均(61.32±4.52)岁;瘤体数量:单个瘤体80例,2个及以上瘤体10例。肿瘤直径为1~17 cm,若瘤体数量为2个及以上,计算其直径总和作为直径数值,其中直径为6 cm及以上者18例,小于6 cm者72例。
1.2 纳入标准与排除标准
1.2.1 纳入标准 1)均经手术切除获得标本,经检查确诊为肝细胞癌;2)标本在离体后30 min内取材,在中性甲醛溶液内保存并固定;3)未合并其他恶性肿瘤,无严重的肝肾功能障碍;4)患者同意自身标本用于临床实验。
1.2.2 排除标准 1)无法接受手术治疗,而是通过化疗或放疗治疗的患者;2)不愿自身资料被用于临床研究;3)其他部位恶性肿瘤转移所致的肝癌患者。
1.3 方法 1)取样:对患者HE切片进行调阅,从每位患者中选取癌细胞含量为70%以上的蜡块,同时选取配对的癌旁正常肝组织蜡块1个,注意将坏死区域、出血区域避开。2)所用试剂和仪器:所用检查试剂盒为FFPE RNA提取试剂盒、qRT-PCR仪,其中SETDB1引物由Primer5.0软件制作,上游引物:5‘-CTATATGACTTCCGGCCGGATGA-3’,下游引物:5‘-GCATTGTCCGAAGGCAGAGA-3’。3)免疫组化染色:将标本组织切片(石蜡包埋)常规脱蜡,实施水化预处理,以抗体稀释液按照1:100的比例对兔抗人SETDB1多克隆抗体进行稀释,在组织切片上滴加抗体,注意需将组织标本完全浸没。放在4 ℃恒温箱中,孵育过夜,将未结合一抗洗净,以辣根过氧化物酶标记后的山羊抗兔二抗和相应一抗结合,以DAB法促使阳性蛋白显示。对各组织切片,于400倍视野下,随机抽查10个视野,若癌细胞胞核有10%以上为棕褐色或棕黄色,则可判定为阳性。4)qRT-PCR检测:将肝细胞癌组织、癌旁组织各个样本切成厚度为5 μm,每份标本共4张切片,放在EP管内,根据试剂盒操作说明书提取其中的总RNA,对其纯度、浓度进行检测,若总RNA纯度(A260/A280)数值为1.8~2.1,则判定为合格。所有样本均采集RNA样品1 μg,实施qRT-PCR反应,其体系20 μL,反应条件为55 ℃下行逆转录,共10 min;之后在95 ℃下行1 min预变性,在95 ℃下实施10 s循环,在60 ℃下行1 min循环,共循环40次。各个样本重复试验3孔。采用2-△△Ct法计算SETDB1相对表达量。
1.4 观察指标 1)评估肝细胞癌组织、癌旁组织中SETDB1的表达情况。2)对不同年龄、性别、肿瘤直径、癌细胞不同分化程度、有无肝硬化患者、不同分型、分期肝细胞癌患者的SETDB1表达情况进行统计分析。
2 结果
2.1 SETDB1的表达情况 免疫组化染色中,SETDB1位置为细胞核内,其阳性表达情况见表1。经对比,癌组织中SETDB1阳性率明显高于癌旁组织(P<0.05)。经qRT-PCR检查,发现肝细胞癌组织中的SETDB1相对表达量为(1.674±0.287),癌旁组织中为(1.215±0.147),经对比差异有统计学意义(t=13.504,P<0.001)。
表1 癌组织和癌旁组织中SETDB1的表达情况
2.2 不同年龄、性别、肿瘤直径患者SETDB1的检测情况 不同年龄、不同性别患者的肝细胞癌样本中,癌组织SETDB1水平组间差异无统计学意义(P>0.05);肿瘤直径为6 cm及以上者的癌组织SETDB1水平明显高于肿瘤直径不足6 cm者(P<0.05)。见表2。
表2 不同年龄、性别、肿瘤直径肝细胞癌患者SETDB1的测定结果
2.3 不同分化程度、有无肝硬化肝细胞癌患者SETDB1的水平 不同癌细胞分化程度、肝硬化患者,癌组织SETDB1水平组间差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。
表3 不同分化程度、有无肝硬化肝细胞癌患者SETDB1的测定结果
2.4 不同分型、分期肝细胞癌患者SETDB1的测定结果 MVI分型中,M1+M2分型的癌细胞SETDB1水平明显高于M0分型(P<0.05);pTNM分期中,Ⅲ+Ⅳ期患者癌细胞SETDB1水平明显高于I +II期(P<0.05)。见表4。
表4 不同分型、分期肝细胞癌患者SETDB1的测定结果
3 讨论
近年来,随着生活环境不断变化、生活方式逐渐改变,全球范围内的癌症患者数量逐渐增多。肝细胞癌属于常见疾病类型,若不能及时治疗,患者死亡风险较高,肝细胞癌的治疗引起了人们的关注,然而部分患者经治疗后,效果仍不佳,故而临床医师近年来日益重视探索肝细胞癌的分子发病机制,希望为此类患者的治疗提供新的靶点[6]。
肝癌表观遗传变异,对于肿瘤的发生和进展,乃至其转移及复发,均可发挥巨大作用。SETDB1属于组蛋白甲基化转移酶,能够和异染色质蛋白1、抑制子KAPI于异染色质内结合,对H3K9me3的形成发挥促进作用[7-8]。目前,有很多研究在多种恶性肿瘤中均发现SETDB1异常表达问题,但是领域内专家对这一物质的生物学功能还未获得明确结论[9]。对于非小细胞肺癌患者,SETDB1可将WNT-β-catenin信号通路正向激活,对肝细胞癌细胞增殖过程发挥促进作用,而在脑胶质母细胞瘤中,也能够发现类似的生物学行为。有研究提出,SETDB1在肝癌中水平较高,且其升高与肝癌进展、侵袭和预后情况密切相关[10]。体外实验发现,沉默SETDB1可对肝细胞癌的迁移、侵袭及增殖能力造成抑制作用[11]。本研究经免疫组化染色可知,肝细胞癌组织中SETDB1阳性表达率明显高于癌旁组织,然后用qRT-PCR技术进行检测,结果发现,肝细胞癌组织中SETDB1相对表达量明显高于癌旁组织,可见SETDB1在肝细胞癌组织内的表达水平较高,而这一指标的检测,能够对肝细胞癌的诊断提供一定依据。
本研究将肝细胞癌患者根据不同方法进行分组,进一步探索不同分期、肿瘤直径等患者的SETDB1表达情况。经对比发现,在不同性别、不同年龄的肝细胞癌患者中,虽然SETDB1表达水平有一定差异,但是差异并无统计学意义,可见性别及年龄不是影响SETDB1表达的因素。在肿瘤直径为6 cm及以上患者中,笔者发现其癌细胞SETDB1水平明显高于肿瘤直径不足6 cm患者,从这一结果可以看出,SETDB1表达水平较高的肝细胞癌组织,SETDB1的表达可能会越发活跃,因此这一指标的水平较高;随着肿瘤体积增大,不仅预示着患者治疗难度增加,同时也提示患者预后可能更差,疾病进展更加严重,由此可见,SETDB1表达情况在肿瘤进展评估中也能发挥重要作用[12-13]。
在不同癌细胞分化程度、是否伴随肝硬化的患者中,癌细胞SETDB1水平组间差异不显著,由此可见,肝硬化的有无并不会影响SETDB1的表达,而癌细胞分化程度与SETDB1表达水平之间也不存在必然的联系。研究还对MVI分型情况展开对比,结果发现,M1+M2分期的癌细胞SETDB1水平明显高于M0分期,而在不同pTNM分期的患者中,Ⅲ+Ⅳ期患者癌细胞SETDB1水平明显高于I +II期,之所以出现这一结果,是因为伴随MVI患者的肿瘤体积通常更大,而患者的生存期一般较短。而TNM分期直接反映肿瘤进展程度,Ⅲ+Ⅳ期的肿瘤进展更快,患者预后一般相对较差。从这一结论可以看出,SETDB1表达情况与微血管侵犯、肿瘤分期密切相关,推断SETDB1水平升高与肝细胞癌患者预后差之间有一定关联,因此可将SETDB1水平用作对肝细胞癌患者肿瘤进展、预后评估的一个重要指标[14-15]。陈静等[16]在研究中,发现对SETDB1进行抑制,可抑制裸鼠皮下移植瘤生长,且可导致细胞中H3K9me3水平下降,p53水平升高。我们体会到,对于SETDB1表达情况与肝细胞癌患者其他病理特征、预后之间的关系,还需继续扩大研究样本量,并考虑其蛋白表达情况,做更深入的分析。
对于肝细胞癌患者,下调SETDB1表达水平,能够对肝癌生长发挥抑制作用,这可作为后续治疗肝细胞癌的重要靶点,领域内专家可通过大量试验,探索抑制SETDB1表达水平的药物及治疗方案,来改善肝细胞癌患者的预后情况。
综上所述,肝细胞癌中组蛋白甲基化酶SETDB1的表达明显升高,且肿瘤直径较大、M1+M2型、pTNM分期较高的患者中,肝细胞癌内SETDB1的表达水平明显升高,这有望为肝细胞癌治疗方案的研制提供新的治疗靶点。