石蜡包埋组织结核分枝杆菌检测方法的对比分析

张继伟，李钦丽，聂 秀

结核病是由结核分枝杆菌引起的极具危害性的肉芽肿性病变，以肺结核最为常见。目前，组织病理学检查已成为结核病诊断的重要手段。抗酸染色作为结核病主要辅助检查手段，其灵敏度、特异性均较低[1-2]。《中国结核病病理学诊断专家共识》提出结核病的病理诊断标准：根据结核病的病理变化及结核分枝杆菌基因检测阳性才能作出明确诊断。文献报道qRT-PCR法通过特异性扩增结核分枝杆菌的DNA，现已成为结核病的检测手段[3-4]。然而，其在石蜡包埋组织结核分枝杆菌检测中的应用较少，且各实验室报道的阳性率差异较大[5-6]。本实验采用qRT-PCR法进行结核分枝杆菌检测，同时与传统的抗酸染色进行比较，结果显示qRT-PCR优于抗酸染色检测，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料收集2018年5月～2019年11月华中科技大学同济医学院附属协和医院病理科经病理拟诊为结核病或符合结核的石蜡包埋组织1 218例，包括手术标本683例和活检标本535例，其中男性716例，女性502例；年龄2个月～83岁，中位年龄50岁。病变组织种类详见表1，其他包括乳腺、子宫腔、腕部、腹腔、胸壁肿物等组织标本159例。

1.2 主要仪器和试剂Mx3000P型荧光定量PCR仪(美国安捷伦公司)，石蜡包埋组织基因组DNA提取试剂盒(QIAGEN公司，德国)，结核分枝杆菌核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)(湖南圣湘生物公司)，抗酸染色液(珠海贝索生物公司)。

表1 病变组织种类及抗酸染色和qRT-PCR法检测

1.3 qRT-PCR检测石蜡包埋组织5 μm厚连续切片，手术标本5片，活检标本10片，置于1.5 mL EP管中，按照石蜡包埋组织基因组DNA提取试剂盒的操作说明书进行样本DNA提取。样本DNA的浓度及纯度经紫外分光光度法检测合格后，按结核分枝杆菌核酸定量检测试剂盒说明书，进行样本结核分枝杆菌检测。样本检测时均设阳性对照和阴性对照。结果分析：目标基因的Ct参考值为39，内标的Ct参考值为40。对于测定Ct≤39的样本，报告为结核分枝杆菌DNA阳性；对于测定Ct>39的样本，同时内标检测为阳性(Ct≤40)，报告注明结核分枝杆菌DNA低于试剂盒检测下限，若内标Ct>40或无显示，该检测无效。

1.4 抗酸染色石蜡包埋组织3 μm厚连续切片，生物透明剂康莱脱蜡2次，每次5 min，去离子水冲洗2 min。滴加石炭酸复红染液染色30 min，染色过程中注意观察染液的液面。去离子水冲洗2 min；分化液分化3～4次，至切片呈无色为止，部分组织可呈淡粉色；去离子水冲洗2 min。亚甲基蓝溶液复染10～30 s，去离子水冲洗2 min。常规脱水、晾干、封片。染色结果判读：抗酸杆菌呈鲜红色，红细胞呈粉红色，细胞核及背景呈淡蓝色。

1.5 统计学方法采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计数资料采用例和百分率表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。采用Kappa检验比较两种方法的一致性。

2 结果

2.1 抗酸染色和qRT-PCR法检测结核分枝杆菌抗酸染色组织中呈亮红色为结核分枝杆菌，长度3 μm左右(可有很大变化幅度)，呈纤细稍弯的杆状或念珠样成堆或散在分布，阴性为浅蓝色背景下不能检出亮红色杆菌(图1)。qRT-PCR检测结核分枝杆菌内标曲线(蓝色曲线)应升起且Ct值≤40，结核分枝杆菌特异性基因扩增曲线(红色曲线)升起且Ct≤39为阳性，否则为阴性(图2)。1 218例标本中抗酸染色阳性率为35.8%(436/1 218)，qRT-PCR检测阳性率为51.2%(624/1 218)，差异有统计学意义(χ2=50.029，P<0.05，表1)。683例手术标本中抗酸染色阳性率为43.5%(297/683)；qRT-PCR检测阳性率为58.4%(399/683)，差异有统计学意义(χ2=30.477，P<0.05)。535例活检小标本中抗酸染色阳性率为26.0%(139/535)，qRT-PCR检测阳性率为42.1%(225/535)，差异有统计学意义(χ2=54.058，P<0.05，表1，图3)。其中病例数大于100例的肺、肠道、骨组织和淋巴结标本中，抗酸染色阳性率分别为44.4%、11.35%、30.7%和42.2%，qRT-PCR检测阳性率分别为63.3%、14.59%、50.4%和55.04%(表1，图4)。

AB

2.2 抗酸染色和qRT-PCR检测结核分枝杆菌的一致性本组1 218例标本中，两种方法检测均阳性376例，均阴性534例，一致性为74.7%(κ=0.498，P<0.05，表2)。其中683例手术标本采用两种方法检测有261例均阳性，248例均阴性，一致性为74.5%(κ=0.501，P<0.05)；535例活检标本采用两种方法检测均阳性115例，均阴性286例，一致性为75.0%(κ=0.458，P<0.05，图5)。在病例数大于100例的肺、肠道、骨组织和淋巴结标本中，两种方法检测的一致性分别为69%、91.3%、74.05%和74.3%(图6)。376例两种方法检测均阳性的标本中，qRT-PCR检测的Ct值80%分布在24～36之间；在248例抗酸染色阴性而qRT-PCR检测阳性病例中，qRT-PCR检测的Ct值则80%分布在30～40之间(图7)。

图2 qRT-PCR法检测结核分枝杆菌：A.阳性；B.阴性

图3 抗酸染色和qRT-PCR法检测手术标本和活检标本中结核分枝杆菌的阳性率

表2 抗酸染色、qRT-PCR法检测结核分枝杆菌一致性分析

3 讨论

本实验中抗酸染色和qRT-PCR检测结核分枝杆菌的阳性率与文献报道的结核分枝杆菌抗酸染色(31%～50.1%)和qRT-PCR检测(50%～75.8%)结果基本一致[5-7]。本组对683例手术标本和535例活检标本同时用两种方法检测，结果发现活检标本抗酸染色和qRT-PCR检测的阳性率为26.0%和42.1%，均显著低于手术标本的抗酸染色(43.5%)和qRT-PCR检测(58.4%)。活检标本阳性率低于手术标本的主要原因：活检标本组织量较少，大部分含菌量较低，经常规HE和免疫组化染色后损失较多，同时活检标本前期组织处理不当更容易导致DNA降解，显著影响结核分枝杆菌qRT-PCR检测。因此，活检标本进行结核分枝杆菌检测时应尽量避免组织损失，且尽量用敏感性高的qRT-PCR法进行检测。

图4 抗酸染色和qRT-PCR法检测不同组织标本结核分枝杆菌的阳性率

图5 抗酸染色和qRT-PCR法检测手术标本和活检标本中结核分枝杆菌的一致性

图6 抗酸染色和qRT-PCR法检测不同组织标本中结核分枝杆菌的一致性

图7 抗酸染色检测结核分枝杆菌与qRT-PCR法检测结核分枝杆菌Ct值分布：A.抗酸染色和qRT-PCR均阳性病例Ct值分布；B.抗酸染色阴性和qRT-PCR阳性病例Ct值分布

本组1 218例石蜡包埋组织中，对450例肺、185例肠道、127例骨组织和109例淋巴结标本，同时采用抗酸染色和qRT-PCR检测结核分枝杆菌的阳性率，结果表明肺标本结核分枝杆菌采用抗酸染色(44.4%)和qRT-PCR(63.3%)检测的阳性率均最高，其次为淋巴结(42.2%和55.04%)、骨组织(30.7%和50.4%)，而肠道标本为11.35%和14.59%。上述结果与结核病在不同组织的发病率一致，表明肺结核最常见。骨组织在标本处理过程中常需要进行脱钙使组织软化，以方便常规HE切片及进行后续的分子检测。临床病理中常用的脱钙液为10%硝酸，可以迅速脱钙、作用效果强，但同时对骨组织也会产生较大的破坏作用，导致标本DNA降解，直接影响qRT-PCR检测结核分枝杆菌的阳性率。研究表明通过优化脱钙骨组织DNA的提取方法，能够增加qRT-PCR检测结核分枝杆菌检测的阳性率。此外，在实际工作中研究者发现，根据骨组织大小，严格控制脱钙时间或更换脱钙效果较温和的脱钙液，也能有效降低骨组织脱钙导致DNA降解。

本实验中抗酸染色和qRT-PCR检测结核分枝杆菌一致性为74.7%，其中手术标本一致性为74.5%，活检标本一致性为75.0%，表明两种方法有较高的吻合性。为进一步明确两种方法的一致性，本实验分析了376例抗酸染色和qRT-PCR检测均为阳性病例和248例抗酸染色阴性而qRT-PCR检测为阳性病例的Ct值分布情况，结果表明376例抗酸染色阳性病例，qRT-PCR检测Ct值80%分布在24～36之间；248例抗酸染色阴性病例，qRT-PCR检测Ct值80%分布在30～40之间，与前者相比，Ct值显著趋近于临界值39。

在实际临床工作中，为保证qRT-PCR检测结核分枝杆菌结果的准确性和可靠性，应注意的是：(1)由于qRT-PCR灵敏度高，为防止污染的发生应尽量在标准的临床基因扩增检验室中进行检测；(2)检测人员应该进行规范化培训，并持有临检中心颁发的PCR上岗证；(3)检测仪器设备和试剂应符合要求；(4)应避免样品间产生交叉污染，在样本制备过程中使用完全清洁的刀片、手套，选用结核分枝杆菌明确阴性的样本与待检测样本同时制备和检测；(5)为避免假阳性的发生，检测结果应结合患者临床症状及其他实验室检查结果进行综合判断。

综上所述，在石蜡包埋组织结核分枝杆菌检测方法中，与传统的抗酸染色相比，qRT-PCR检测方法具有敏感性高、特异性强等特点，对结核病的组织学病理诊断，尤其是活检标本的病理诊断具有重要的应用价值，可显著提高结核病的检出率。由于qRT-PCR检测可能出现假阳性或假阴性，为提高结核病的病理诊断准确性，应根据病理形态学改变并结合抗酸染色结果进行诊断。