溃疡性结肠炎患者及其配偶的肠道菌群构成与多样性分析

吴佳倩 马芳笑 吴佩 钟继红 刘英超*

溃疡性结肠炎（UC）主要是以累及直肠和结肠的慢性非特异性炎症性肠病。研究表明，UC在欧洲的发病率已达0.97～57.9/10万人，亚洲和中东近几年发病率快速上升，达0.15～6.5/10万人［1-2］。目前认为UC是免疫、遗传、环境及肠道菌群等多因素共同作用的结果。研究表明，某些肠道菌群释放大量毒素损伤黏膜，诱导细胞死亡并刺激细胞炎症因子释放，引起肠道黏膜炎症反应［3-4］。此外，外界环境同样是引起UC发病的因素之一［5］。本文比较UC患者与其同一生活环境下患者家属，以及与正常体检人群肠道菌群的差异性，探讨生活环境与肠道菌群环境间的相关性在UC发病中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2019年1月至7月浙江中医药大学附属第二医院UC患者8例（UC组）及其配偶8例（UF组），同时招募本院体检健康者8例（ZC组）。本项目经本院医学伦理委员会批准。（1）纳入标准：①年龄18～60岁，性别不限；②根据患者临床表现、肠镜及病理结果，参照《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见（2018年）》［6］的UC诊断标准，由消化内科及病理科医师共同确诊为UC。③UC配偶组需与UC患者共同生活至少5年、无全身系统性疾病且肠镜检查正常；④健康人群组需与UC患者无血缘关系且不在同一家庭环境下生活；⑤健康人群组无全身系统性疾病且肠镜检查未见肠道病变；⑥所有入选者均签署知情同意书。（2）排除标准：①重度或急性暴发型UC患者；②近2个月内使用抗生素、益生菌制剂及清洁灌肠者；③既往有消化道疾病手术史；④妊娠及哺乳期女性、儿童及精神病患者；⑤患有严重心、脑、肺、肝、肾疾病或高血压、心脏病、糖尿病等慢性疾病。

1.2 方法 （1）粪便样本采集：采集所有入选者自然排出的新鲜粪便（＞2 g），迅速将粪便装于无菌样品管中，样品管冰浴1 h内运送至中心实验室无菌条件下进行分装，液氮冷却后置于-80 ℃超低温冰箱中保存。（2）样本DNA提取、基因组PCR扩增及16S rRNA测序：应用QIAamp DNA Stool Extraction Kit试剂盒从粪便样本中提取肠道微生物基因组DNA后，使用引物341F（5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'）和805R（5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）［7］对细菌16S rRNA基因的V3-4可变区进行PCR扩增［7］。扩增条件为95℃解链3 min，95℃30 s，55℃，30 s，72℃45 s，25个循环，72 ℃延伸5 min。用1.0%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行质检并纯化。利用Nextera XT Index Kit中的引物在待测DNA的两端接入adaptor序列，用于后续MiSeq上机测序。（3）测序数据分析：剔除原始序列中不含引物、长度在300～480 bp以外、质量评分≤20、含有模糊碱基N及嵌合体的序列，得到最终用于分析的优质序列。将相似度在97%的优质序列聚类为一个操作分类单元（OTU），并用SILVA数据库进行生物学鉴定。最终得到所有OTU表，采用Qiime 软件进行多样性指数分析、主成分分析及菌落组成分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS 26.0统计软件。计量资料以（±s）表示，多组间比较用方差分析，多重比较采用LSD-t检验；方差不齐时，采用Kruskal-wallis H检验。计数资料组间比较采用卡方检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组基线资料比较 见表1。

表1 三组基线资料比较（±s）

表1 三组基线资料比较（±s）

组别 n 年龄（岁） 男/女（n） BMI（kg/m2）ZC组 8 36.00±7.31 4/4 20.70±1.99 UC组 8 43.38±11.75 4/4 21.09±0.68 UF组 8 41.89±18.39 4/4 21.11±1.32

2.2 肠道菌群物种多样性分析 物种多样性分析采用Alpha多样性指标，Alpha多样性是反映丰富度和均匀度的综合指标。丰富度即种类数目；多样性即群落中个体分配上的均匀性。本研究中群落丰富度的指数以Chao1指数表示。群落多样性的指数以Shannon指数表示。（1）Chao1指数：每条曲线代表一个样本，末端数字为实际测序条数。Chao1指数越大，表明群落的丰富度越高。测序序列从15,000起曲线趋于平坦，表明此时测序已趋于饱和，测序数据量合理。三组间Chao1指数差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。（2）Shannon指数：每条曲线代表一个样本，末端数字为实际测序条数。Shannon指数值越高，表明群落的多样性越高。测序序列曲线较早趋于平坦，表明此时测序已趋于饱和，测序数据量合理。三组间Shannon指数差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2。

图1 Chao1指数曲线

图2 Shannon指数曲线

2.3 肠道菌群门分类水平分析 所有样本共检出18个细菌门（见图3）。其中，厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形杆菌门（Proteobacteria）、梭杆菌门（Fusobacteria）以及放线菌门（Actinobacteria）的相对丰度依次递减，且总量占所有菌群数量的99.9%。与UC组比较，ZC组及UF组中厚壁菌门与梭杆菌门的相对丰度平均值均增加，厚壁菌门分别增加5.73%和3.74%，梭杆菌门分别增加1.06%和6.09%；而拟杆菌门的相对丰度均值分别减少2.83%和10.87%。与ZC组比较，UC组及UF组中变形菌门的相对丰度均值分别增加2.77%和3.28%；放线菌门分别增加1.21%和1.62%。三组样本间肠道菌群的相对丰度差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

图3 门分类水平上三组样本肠道菌群的相对丰度

表2 三组肠道菌群门水平的相对丰度比较［%，（±s）］

表2 三组肠道菌群门水平的相对丰度比较［%，（±s）］

组别 厚壁菌门 拟杆菌门 变形杆菌门 梭杆菌门 放线菌门ZC组 53.90±23.64 41.60±22.38 2.31±1.66 1.08±2.64 1.01±0.95 UC组 48.17±12.43 44.43±11.24 5.08±4.63 0.02±0.017 2.22±1.99 UF组 51.91±1.09 33.56±14.40 5.59±4.33 6.11±10.19 2.63±5.26

2.4 肠道菌群属分类水平分析 所有样本共检出240个菌属，相对丰度前35的菌属在各组样本中的构成情况见图4。ZC组优势菌属：厚壁菌门的粪杆菌属（Faecalibacterium）、拟杆菌门的拟杆菌属（Bacteroides）及普雷沃菌属（Prevotella）；UC组及UF组优势菌属：拟杆菌门的拟杆菌属、 厚壁菌门的粪杆菌属及罗斯菌属（Roseburia）。所有菌属中共有15个菌属在属分类水平上组间分布差异有统计学意义，其中前5类菌属差异有显著统计学意义。与UC组比较，ZC组及UF组的考拉杆菌属（Phascolarctobacterium）的相对丰度增高（P＜0.05）；与UF组比较，ZC组及UC组的锥形杆菌属（Pyramidobacter）的相对丰度降低（P＜0.05）；与ZC组比较，UC组及UF组奥尔森菌属（Olsenella）、霍尔德曼菌属（Holdemania）、克雷伯菌属（Klebsiella）的相对丰度增高（P＜0.05）。（见图5及表3）。

图4 属分类水平上三组样本肠道菌群的相对丰度

表3 三组肠道菌群属水平相对丰度比较［%，（±s）］

表3 三组肠道菌群属水平相对丰度比较［%，（±s）］

注：与UC组比较，*P＜0.05；与UF组比较，#P＜0.05；与ZC组比较，△P＜0.05

组别 考拉杆菌属 奥尔森菌属 锥形杆菌属 霍尔德曼菌属 克雷伯菌属ZC组 1.58±0.75*0.0005±0.001 0.00±0.00# 6.64±4.83 0.02±0.03 UC组 0.21±0.52 0.006±0.007△0.00±0.00# 8.59±8.47△1.74±3.24△UF组 2.23±2.86*0.006±0.016△0.004±0.005 8.00±7.52△1.04±1.74△

图5 属分类水平上三组样本差异性肠道菌群的相对丰度Image图

3 讨论

肠道菌群与溃疡性结肠炎的发病机制密切相关，在正常生理状态下，肠腔内有益菌群及有害菌群相互制约、相互依存，共同维持肠道稳态。一旦肠道微生态失衡，有益菌减少而致病菌繁殖增加，侵袭、破坏肠黏膜屏障进而引发肠黏膜免疫反应，导致慢性炎症和组织损伤［8-10］从而引起UC发病。

本研究显示，三组间Chao1指数及Shannon指数的差异无统计意义。表明三组间菌群丰富度及群落物种多样性存在相似性，但每个菌种具体相对丰度的差异还需进一步的分析。比较健康人群、UC患者及其配偶的差异性菌属，发现UC患者肠道内考拉杆菌属的相对丰度明显降低。考拉杆菌属是短链脂肪酸——丁酸及丙酸的生产者，后者可经SCFA / GPCR途径抑制NLRP3炎症小体激活及炎症因子分泌；同时诱导结肠调节T细胞（Treg）的分化，维持结肠免疫耐受及应答间的平衡［11-12］。LUKAS等［13］研究发现，考拉杆菌属在UC肠道中明显减少。本研究结果与上述研究相一致，提示考拉杆菌属可能是UC患者发病的标志性菌群。

此外，UC组及UF组优势菌属均为拟杆菌门的拟杆菌属、 厚壁菌门的粪杆菌属及罗斯菌属，而健康人群组的优势菌属为厚壁菌门的粪杆菌属、拟杆菌门的拟杆菌属及普雷沃菌属。与ZC组比较，UC患者组及其配偶组肠道内奥尔森菌属、霍尔德曼菌属及克雷伯菌属的相对丰度升高。奥尔森菌属归属于放线菌门，是一种条件性致病菌［13］。研究报道奥尔森菌属的减少有助于减轻肠黏膜炎症损伤［14］。霍尔德曼菌属归属于厚壁菌门，有研究表明饮酒会引起此菌属丰度的上升［15］，其可能参与一些疾病的发生发展过程。克雷伯菌属归属于变形杆菌门，是一种寄居机体肠道的条件致病菌。机体健康状态下保持沉默，但当机体抵抗力下降、肠道菌群失调时，其将迅速繁殖、破坏肠黏膜屏障，从而引发遗传易感人群严重的肠道炎症反应［16］。本研究已排除血缘关系等其他混杂因素后，发现UC组与UF组肠道内霍尔德曼菌属、克雷伯菌属及奥尔森菌属的相对丰度较健康人群显著升高。因此，作者推测以上2种菌属可能随着生活环境或日常饮食改变而变化，在一定条件下可能促发UC易感人群发病。相比传统细菌培养鉴定，16S rRNA基因测序技术对菌群构成的分类准确率更高。本研究从UC患者及其配偶肠道中检测到可能与UC发生发展相关的差异菌群：如考拉杆菌属、奥尔森菌属及克雷伯菌属。上述菌群的发现将为针对肠道菌群靶点的UC精准治疗提供新思路。

综上所述，考拉杆菌属、奥尔森菌属及克雷伯菌属可作为UC肠道菌群失调预后及治疗的潜在生物学标志物。此外，人体肠道菌群结构与数量因生活环境的不同会产生一定差异，但这种差异不一定会引起机体发病，多种因素共同作用导致UC易感人群的肠道微环境失衡是UC的重要发病机制。