鸡传染性喉气管炎病毒贵州株gD基因的遗传进化分析

赵 超， 张启琴， 陈 静， 尹德晶， 肖 丽， 吴斌凤， 胡 茜， 刘 婷， 郭小江， 程振涛，2*

(1. 贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025； 2. 贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室，贵州 贵阳 550025； 3. 贵州省草地技术实验推广站，贵州 贵阳 550025)

鸡传染性喉气管炎(Avian infectious laryngotracheitis，AILT) 是由传染性喉气管炎病毒 (Infectious laryngotracheitis virus，ILTV) 引起鸡的1种急性、高度接触性传染病[1]。我国于20世纪50年代末期首次报道有该病发生，90年代后在我国一些地区呈地方流行性[2]。其感染后主要侵害鸡的上呼吸道，发病率高，传播速度快，给我国的养鸡业造成很大损失。ILTV 属于疱疹病毒科，α-疱疹病毒亚科，禽疱疹病毒Ⅰ 型，是二十面体对称的双链DNA病毒；gD基因是该病毒的主要糖蛋白基因，对于病毒的吸附及侵入是必需的，也是病毒繁殖的必需基因，能够诱导机体产生细胞和体液免疫应答[3]。本试验对在贵州省开阳县某养鸡场分离的ILTV贵州株gD基因进行PCR扩增、克隆、序列及遗传进化分析，以了解该毒株的遗传进化情况，为防控疫苗选择提供依据。

1 材料与方法

1.1 病料采集贵州省开阳县某养鸡场ILTV感染鸡喉头和气管样品4份。

1.2 主要试剂DNA提取试剂盒、DL 2 000 DNA Marker、2×TaqPCR Master Mix、pMD-18T载体试剂、限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ(购自大连宝生物工程有限公司)；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒(购自Omega公司)；大肠杆菌感受态细胞DH5α(贵州大学动物疫病研究所制备并保存)；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 主要仪器凝胶成像仪(购自天能科技有限公司)、多功能梯度PCR仪VeritiTM96-Well Thermai(购自美国ABI公司)、DYY-8C型电泳仪器电源(购自北京市六一仪器厂)、QYC-2102C恒温培养摇床(购自上海新苗医疗器械制造有限公司)、恒温金属浴(购自上海蓝貌实验仪器有限公司)。

1.4 引物设计合成参考GenBank数据库中ILTVgD基因序列(登录号：MK895002.1)，设计并合成1对特异性引物(见表1)，预扩增长度1 134 bp，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。引物稀释成浓度为10 pmoL/μL，-20 ℃保存备用。

表1 引物序列信息

1.5 PCR扩增与克隆测序取病死鸡喉头和气管，加入适量PBS，研磨均匀，离心提取上清液，应用DNA提取试剂盒提取总DNA，以其为模板对目的基因进行扩增。PCR反应体系25 μL：DNA模板 2 μL，2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物(10 pmol/μL)各1 μL，ddH2O 8.5 μL。反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，59 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃延伸 10 min。 PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，用凝胶成像系统拍照记录。将目的片段按胶回收试剂盒说明书方法进行回收纯化，纯化后的PCR产物与pMD18-T载体连接。连接体系10 μL：连接酶Solution I 5 μL，纯化后的PCR产物4 μL，pMD18-T载体1 μL。连接条件：4 ℃过夜。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中。将转化感受态细胞菌液加入LB液体培养基 1 mL中，37 ℃ 150 r/min活化1.5 h。取活化菌液200 μL均匀涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基，37 ℃选择培养 18 h，取单个菌落进行PCR检测(方法同上)，相应单菌落培养液提取重组质粒，并进行质粒PCR鉴定和双酶切鉴定。质粒PCR扩增反应体系及程序同上。双酶切体系 30 μL：HindⅢ 1.5 μL，BamH Ⅰ 1.5 μL，10×Buffer 3 μL，重组质粒cDNA 8 μL，ddH2O 16 μL。 双酶切条件：37 ℃恒温水浴过夜。经质粒PCR、双酶切方法鉴定为阳性的重组质粒送上海生物工程有限公司测序。

1.6 序列分析应用MegAlign生物信息学软件对测序结果进行核苷酸序列同源性和系统进化树分析。

2 结果

2.1 目的基因PCR扩增PCR产物电泳结果显示，扩增出1 134 bp目的基因条带(见图1)，与预期相符。

M：2 000 bp分子质量标准； 1～4：4份组织样品； 5：阴性对照图1 目的基因PCR扩增结果

2.2 重组质粒PCR鉴定PCR鉴定结果显示，目的基因成功克隆至pMD18-T载体(见图2)。

M：2 000 bp分子质量标准； 1～2：重组质粒； 3：阴性对照图2 重组质粒PCR鉴定结果

2.3 重组质粒双切酶鉴定双酶切鉴定结果显示，重组质粒酶切出现2 692 bp载体条带和1 134 bp目的基因条带，证明目的基因片段与载体pMD18-T连接成功，成功获得阳性重组质粒(见图3)。

M：2 000 bp分子质量标准； 1～2重组质粒； 3：阴性对照图3 重组质粒双酶切鉴定结果

2.4 目的基因序列分析

2.4.1gD基因基因序列同源性分析同源性分析结果显示，ILTV 贵州株gD基因序列与国内黑龙江、江苏、上海和国外澳大利亚、突尼斯、美国、意大利的分离株gD基因的同源性均较高，在98.9%～99.1%之间，说明ILTV 贵州株gD基因遗传较稳定，变异程度低(见图4)。

2.4.2 遗传进化树分析遗传进化树分析结果显示，ILTV贵州株与上海、黑龙江、江苏、澳大利亚、突尼斯的分离株处于同一分支，亲缘关系较近；而与美国分离株处于不同分支，亲缘关系较远(见图5)。

图5 ILTV贵州株遗传进化树分析

4 结论

本实验基于ILTV的gD基因设计特异性引物，应用PCR、基因克隆、测序分析等方法对gD基因进行分析，结果显示：ILTV贵州株gD基因遗传稳定，进化保守，未发生明显变异，可为防控疫苗选择提供依据。

5 讨论

鸡传染性喉气管炎是1种严重的急性呼吸道病毒传染病，其发生和流行十分普遍，目前呈世界性分布，导致育成鸡生长受阻及产蛋鸡产蛋率下降，严重影响生产效益[4]。根据其临床症状可分为喉气管型和结膜型，传播速度快，感染率高，但死亡率低[5]。由于该病与传染性支气管炎、新城疫、传染性鼻炎等的症状极其相似，且都具有传染性，因此可从病原核酸检测和血清学抗体检测进行确诊。ILTV通过侵入鸡的喉头、呼吸窦等组织进行感染，潜伏期长，若不采取净化措施会出现长期潜伏在鸡体内的情况，从而加大防控难度[6]。目前该病在临床治疗上还没有特效药，疫苗免疫接种是防控其发生和流行的最有效手段，用于该病的疫苗主要有弱毒疫苗和基因重组疫苗[7]。

本试验通过对ILTV贵州株gD基因进行遗传进化分析，发现该毒株gD基因较保守，遗传稳定性强，变异性低，现有的ILTV疫苗可以对该毒株进行免疫防控。养殖场在做好日常防控管理工作的同时，应选择相应疫苗进行针对性免疫。