金银花药材、标准汤剂、中间体、配方颗粒HPLC特征图谱相关性研究

郭 晨 李 夕 郭珮怡 杨建刚 杨海燕 曹爱兰 张 俏

1.陕西医药控股医药研究院有限公司药物质量研究部，陕西西安 710000；2.陕西省食品药品监督检验研究院，陕西西安 710000；3.陕西中药研究所 陕西医药信息中心，陕西咸阳 712000

金银花为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或带初开的花，具有清热解毒，疏散风热的功效[1-2]。金银花作为传统中药材，含有黄酮类、有机酸类、环烯醚萜苷类、三萜皂苷类、挥发油类、无机元素类、有机元素类等[3-5]多种化学成分，在解热、抗炎[6-9]、抗菌[10-13]、抗病毒[14-15]等方面均发挥较显著疗效，同时在抗肿瘤、抗衰老、抗氧化、降低血糖、保肝、保护肺脏、保护神经、治疗妇科疾病等方面亦表现出一定的作用[16]。由于该药化学成分种类较多、极性强、含量差异大，采用传统方法研究金银花中的有效成分难度较大、耗时较长，因此，找到快速、高效地方法对金银花中的化学成分进行分析、检测、辨别，对提升其质量标准具有重要意义[17]。

金银花配方颗粒是以金银花药材为原料，经过提取、浓缩、干燥、制粒等工艺制备而成，失去了金银花药材的外观特征，难以直接鉴别，且很难用某一成分作为质量控制指标来全面衡量配方颗粒的品质，需要制订专属性、重复性更强且更加有效的方法来控制金银花药材配方颗粒的质量。特征图谱的研究能很好地为金银花配方颗粒在化学成分层面上的定性鉴别提供依据。为保证金银花配方颗粒安全、有效、质量可控，本研究采用HPLC法建立金银花药材、标准汤剂、中间体、配方颗粒的特征图谱，并比较四者主要化学成分的差异。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪（Thermo Scientific U3000紫外检测器、二极管阵列检测器）；电子分析天平（Ag135、Ag285、PB3002-S，梅特勒）；超声波清洗器（KQ5200型，昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

乙腈（色谱纯，S41A1，HoneyWell）；甲醇（分析纯，2018072501，成都市科隆化学品有限公司）；磷酸（分析纯，2014102401，成都市科龙化工试剂厂）；水为超纯水。

绿原酸对照品（CAS号：327-97-9，批号：110753-201817，纯度：96.8%，中国食品药品检定研究院）；新绿原酸对照品（CAS号：906-33-2，批号：1025257186，纯度：≥98.0%，SIGMA）；隐绿原酸对照品（CAS号：905-99-7，批号：P30A9L69104，纯度：≥98.0%，上海源叶生物科技有限公司）；异绿原酸A（3，5-O-二咖啡酰奎宁酸）对照品（CAS号：2450-53-5，批号：Y24N8Y49 009，纯度：≥98.0%，上海源叶生物科技有限公司）；异绿原酸B（3，4-O-二咖啡酰奎宁酸）对照品（CAS号：14534-61-3，批号：P20J9F53191，纯度：≥98.0%，上海源叶生物科技有限公司）；异绿原酸C（4，5-O-二咖啡酰奎宁酸）对照品（CAS号：32451-88-0，批号：P25J9L 66496，纯度：≥98.0%，上海源叶生物科技有限公司）。

15批金银花药材（编号、产地依次为：S1-河南、S2-山东、S3-山东、S4-山东、S5-山东、S6-山东、S7-陕西柞水下梁镇、S8-陕西山阳县户坦镇、S9-陕西镇安县采粮镇、S10-山东、S11-山东、S12-山东、S13-湖北、S14-湖北、S15-湖北）；15批金银花标准汤剂（编号依次为：S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S12、S13、S14、S15，来源：自制）；15批金银花中间体（编号依次为：S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S12、S13、S14、S15，来源：自制）；15批金银花配方颗粒（编号依次为：S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S12、S13、S14、S15，来源：自制）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Thermo Scientific AcclaimTM120 C18（5 μm，4.6×250 mm）；流动相：乙腈为流动相A，0.4%磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，洗脱程序见表1；检测波长：327 nm；柱温：30℃；流速：1 mL/min；进样量：10 μL；理论板数按绿原酸峰计算应不低于2000[1]。

表1 梯度洗脱程序

2.2 对照品及供试品溶液的制备

2.2.1 参照物溶液的制备 取绿原酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，制成浓度为40 μg/mL的溶液，摇匀，即得。

2.2.2 混合对照品溶液的制备 取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，制成浓度分别为40 μg/mL的混合对照品溶液，摇匀，即得。

2.2.3 金银花药材供试品溶液的制备 取金银花药材粉末约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，称定重量，超声处理（功率250 W，频率35 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 mL，置25 mL棕色量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.2.4 金银花标准汤剂的制备 取金银花药材100.0 g，加水量一般以浸过药材平面2～5 cm为宜，浸泡30 min，提取两次，每次15 min，过滤，合并两次的提取液，减压浓缩，即得标准汤剂供试品。

2.2.5 金银花标准汤剂供试品溶液的制备 取标准汤剂供试品适量，制备方法同“2.2.3”项下。

2.2.6 金银花中间体的制备 取金银花药材2000.0 g，加12倍量水，浸泡30 min，提取两次，每次30 min，过滤，合并两次的提取液，滤液浓缩至相对密度为1.05～1.15（60℃），喷雾干燥，即得中间体供试品。

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2.2.7 金银花中间体供试品溶液的制备 取中间体供试品适量，制备方法同“2.2.3”项下。

2.2.8 金银花配方颗粒的制备 取金银花药材2000.0 g，加12倍量水，浸泡30 min，提取两次，每次30 min，过滤，合并两次的提取液，滤液浓缩至相对密度为1.05～1.15（60℃），喷雾干燥，加入糊精制粒，即得配方颗粒供试品。

2.2.9 金银花配方颗粒供试品溶液的制备 取配方颗粒供试品适量，制备方法同“2.2.3”项下。

2.3 方法学考察

借鉴2015年版《中华人民共和国药典》一部[1]中金银花提取物质量标准，通过流动相的比较、检测波长的选择、检测时长的确定、提取溶剂的选择等条件选择实验，最终确定选取金银花中6个绿原酸类成分为目标成分。通过实验建立了以绿原酸为参照物，同时评定金银花药材、标准汤剂、中间体、配方颗粒中新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A和异绿原酸C[18-23]的特征图谱分析方法。

2.3.1 精密度试验 按照“2.2”项下方法制备金银花4个品种供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件分别连续进样6次，每次10 μL，结果6个共有峰保留时间RSD小于0.06%、0.07%、0.07%、0.07%，峰面积RSD小于0.28%、0.16%、0.12%、0.15%，说明该方法精密度良好，符合特征图谱的要求。

2.3.2 稳定性试验 按照“2.2”项下方法制备金银花4个品种供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件分别于0、4、8、12、16、20、24 h进样，每次10 μL[5]，结果6个共有峰保留时间RSD小于0.18%、0.19%、0.17%、0.17%，峰面积RSD小于0.60%、0.28%、0.22%、1.50%，说明24 h稳定性良好，符合特征图谱的要求。

2.3.3 重复性试验 按照“2.2”项下方法分别制备金银花4个品种供试品溶液各6份，按照“2.1”项下色谱条件分别进样，每次10 μL，结果6个共有峰保留时间RSD小于0.04%、0.04%、0.09%、0.04%，说明该方法重复性良好，符合特征图谱的要求。

2.3.4 耐用性试验 按照“2.2”项下方法制备金银花4个品种供试品溶液，分别调整流速（0.8、1.2 mL/min），调整柱温（25、35℃），调整流动相中乙腈、水相的比例（乙腈比例增加2.5%、水相比例增加2.5%）分别进样检测，并与“2.1”项下原色谱条件进样检测结果进行比较。供试品色谱中均呈现6个特征峰，与绿原酸参照图谱进行比对，与绿原酸峰保留时间一致的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间[24]，除水相比例增加2.5%和调整流速为0.8 mL/min条件下的相对保留时间在规定值的±8%之内，其余均在规定值的±5%之内，规定值为：0.76（峰1）、1.00（峰2）、1.05（峰3）、1.80（峰4）、1.87（峰5）、2.01（峰6）[1]，所以该方法耐用性基本良好。

2.4 特征图谱的建立

2.4.1 金银花药材、标准汤剂、中间体、配方颗粒特征峰的确定 按照“2.2”项下方法分别制得混合对照品溶液和金银花4个品种供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件分别精密吸取10 μL，注入高效液相色谱仪，进行全波长扫描。通过比对各色谱峰保留时间和紫外吸收图谱，指认其中6个色谱峰[25]，分别为：峰1-新绿原酸，峰2-绿原酸，峰3-隐绿原酸，峰4-异绿原酸B，峰5-异绿原酸A，峰6-异绿原酸C，见图1。选择6个共有峰中保留时间适中，且为检测指标成分的绿原酸峰作为S峰。

2.4.2 金银花药材、标准汤剂、中间体、配方颗粒特征图谱的建立按照“2.2”项下方法分别制备 15批金银花药材、标准汤剂、中间体、配方颗粒供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件分别进样检测，将色谱图导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”，采用中位数法，对色谱图进行匹配，分别得到特征图谱。

图1 混合对照品图谱

金银花药材中确定了6个共有峰，且15批金银花药材相似度均达到0.90以上，说明金银花药材各产地间化学成分组成基本一致。见图2。

图2 15批金银花药材HPLC特征图谱

金银花标准汤剂匹配出8个共有峰，但7、16 min左右的两个小峰一部分批次不易识别，所以并未作为特征峰。15批金银花标准汤剂相似度均达到0.90以上，说明金银花标准汤剂质量均一、工艺稳定。见图3。

图3 15批金银花标准汤剂HPLC特征图谱

金银花中间体匹配出8个共有峰，但7、16 min左右的两个小峰一部分批次不易识别，所以并未作为特征峰。15批金银花中间体相似度均达到0.90以上，说明金银花中间体质量均一、工艺稳定。见图4。

金银花配方颗粒确定了6个共有峰，且15批金银花配方颗粒相似度均达到0.90以上，说明金银花配方颗粒质量均一、工艺稳定。见图5。

图4 15批金银花中间体HPLC特征图谱

图5 15批金银花配方颗粒HPLC特征图谱

本研究采用HPLC法建立了金银花药材、标准汤剂、中间体、配方颗粒的特征图谱，方法学考察结果表明此方法准确、可行、重复性良好，可用于金银花药材、标准汤剂、中间体、配方颗粒的质量控制。

2.4.3 金银花药材、标准汤剂、中间体、配方颗粒相关性分析 将金银花药材、标准汤剂、中间体、配方颗粒对照图谱导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012版）”，采用中位数法，对其匹配并进行相似度计算，匹配图谱见图6，相似度结果见表2。

3 讨论

本试验采用HPLC法建立了金银花药材、标准汤剂、中间体、配方颗粒的特征图谱，方法学考察中：精密度、稳定性、重复性的RSD均小于3%；耐用性，均符合系统适用性要求，除水相比例增加2.5%和调整流速为0.8 mL/min条件下的相对保留时间在规定值的±8%之内，其余均在规定值的±5%之内，规定值为：0.76（峰1）、1.00（峰2）、1.05（峰3）、1.80（峰4）、1.87（峰5）、2.01（峰6）[1]，通过方法学考察试验结果可知，该方法适合用于金银花药材、标准汤剂、中间体、配方颗粒的特征图谱检测。

图6 金银花药材、标准汤剂、中间体、配方颗粒对照图谱匹配图

表2 金银花药材、标准汤剂、中间体、配方颗粒对照图谱相似度评价结果

本研究中，金银花药材与标准汤剂、中间体及配方颗粒的对照图谱的主要峰基本一致，主要化学成分组成基本相同，但是相似度未全达到0.9，仅接近0.8，说明金银花药材在提取后，其成分上有一定变化，并且可以看出酚酸类成分的两组同分异构体在比例上也有明显的改变，如异绿原酸A（3，5-O-双咖啡酰奎宁酸）的比例在提取后明显降低，而新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B（3，4-O-双咖啡酰奎宁酸）、异绿原酸C（4，5-O-双咖啡酰奎宁酸）的比例明显升高；金银花配方颗粒与标准汤剂的相似度达到了0.97以上，说明配方颗粒与标准汤剂化学成分组成基本一致，两者具有相同的药用物质基础。因此，以金银花标准汤剂为基准，标化金银花配方颗粒的质量有助于实现临床用药的一致性和安全性。