蒙药文冠木黄酮类有效成分的提取及含量测定

刘 君 董秋梅

内蒙古医科大学中医学院，内蒙古呼和浩特 010110

蒙古族药文冠木（Xanthoceras sorbifolia Bunge），为无患子科植物文冠果的茎干，蒙语名霞日-森登，有祛风止痛，散湿化瘀之功效，可治疗类风湿性关节炎（RA）、痛风等[1-2]。前期研究显示[3]，蒙药森登-4可抑制RA模型大鼠滑膜新生血管增生，对胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠骨破坏及CIA-FLS体外增殖有明显抑制作用[4]。文冠木是其有效组成之一，含有丰富的黄酮类化合物。黄酮类化合物由5000多种结构不同的天然化学物质组成[5]，可预防多种疾病，如抗癌、抑菌[6-7]、预防人类骨质流失[8]、抗病毒[9]、抗动脉粥样硬化[10]，且对糖尿病、风湿等免疫性疾病有疗效[11-12]，另文冠果对阿尔茨海默病有抑制作用，可改善记忆障碍[13-14]。近年对于文冠木药材的分离和提取[15-17]，质量标准有报道[18-20]，但对文冠木主要黄酮类成分槲皮素和表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的质量控制未见研究。文冠木内含量较高的活性成分有二氢杨梅素、槲皮素、杨梅素、EGCG等[21]，本研究旨在建立槲皮素和EGCG含量测定方法，为其质量控制提供参考，以期为研究单药的有效成分及药物的研发提供科学依据。

1 仪器与试药

槲皮素对照品（批号：20191125，纯度：＞99%）、EGCG对照品（批号：20191126，纯度：＞99.89%）均购自成都德思特公司；文冠木药材购自内蒙古国际蒙医院，经内蒙古医科大学中药教研室任长胜教授鉴定为文冠木。色谱级甲醇和乙腈，水为超纯水。

液相色谱仪（美国Waters2695型）；BenchTop Pro真空冷冻干燥机（美国）；大孔树脂（安徽三星树脂科技有限公司）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；梅特勒-托利多分析天平（精密度：0.0005～0.0100 mg）

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 供试品溶液 5 kg文冠木经蒸馏水浸泡1 h，水煎提取1 h，趁热过滤药液。60℃恒温减压浓缩。将浓缩后的文冠木提取物置于真空冷冻干燥机低温升华干燥8 h后，密封置于4℃冰箱储存备用。用AB-8大孔树脂分离提纯，用水-95%乙醇体系不断洗脱得到目标段化合物后，再逐步减压浓缩约200 mg。称取文冠木提取物0.2 g，加入甲醇50 mL；以150 W、50 kHz超声30 min，冷却，称重，用0.45 μm微孔滤膜过滤后制成供试品溶液。

2.1.2 对照品溶液 称取槲皮素对照品4.82 mg，EGCG对照品4.91 mg，用甲醇溶解并定容，得到槲皮素0.241 mg/mL、EGCG 0.246 mg/mL对照品溶液。

2.2 色谱条件

色谱柱：Hypersil C18色谱柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脱（0～45 min，95%A；45～46 min，40%A；46～50 min，95%A）；检测波长：225 nm；流速：1 mL/min；柱温：28℃；进样量：20 μL。

取文冠木供试品、槲皮素和EGCG对照品溶液进样测定，各待测成分的色谱峰与相邻峰间分离度大于1.5，理论板数均在3000以上。见图1。

2.3 检测限与定量限

取槲皮素、EGCG对照品各适量，精密称定后分别置于量瓶中，用流动相溶解并逐级稀释至一定溶度，按“2.3”项下色谱条件进样分析，记录色谱图，以信噪比（S/N=3±1）的浓度为检测限，信噪比（S/N=10±1）的浓度为定量限。见表1。

2.4 线性范围考察

分别量取“2.1.2”项下对照品溶液，用甲醇稀释至槲皮素对照品浓度为0.060、0.121、0.241、0.482、0.964 mg/mL；EGCG对照品浓度为0.062、0.123、0.246，0.492、0.984 mg/mL，按“2.2”项下色谱条件进样分析，记录色谱图。以峰面积Y为纵坐标，对照品浓度X为横坐标，进行线性回归分析，绘制标准曲线，求槲皮素、EGCG对照品的回归方程。见表1。

图1 对照品及供试品色谱图

表1 槲皮素和EGCG线性范围考察及检测限、定量限

2.5 精密度

取“2.1.1”项下供试品溶液，连续进样6次，计算槲皮素和EGCE峰面积的RSD值。结果槲皮素和EGCG峰面积的平均RSD分别为1.04%、1.06%。

2.6 重复性

取“2.1.1”项下供试品溶液6份，进样测定槲皮素、EGCG峰面积的RSD值。结果显示，槲皮素、EGCG峰面积的平均RSD值均小于1.83%，表明该分析方法具有良好的重复性。

2.7 稳定性

取“2.1.1”项下供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h进样测定槲皮素、EGCG峰面积的RSD值。结果显示，不同时间点槲皮素、EGCG峰面积平均RSD值均小于1.83%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.8 加样回收率

称取文冠木提取物0.2 g，共6份，分别加入槲皮素和EGCG对照品适量，按“2.1.1”项下方法制备，按“2.2”项下条件进样分析，在相同色谱条件下，反复进样6次，计算回收率。见表2。

表2 加样回收率

2.9 槲皮素和EGCG含量

3个批次文冠木提取物按“2.2.1”项下条件制备，按“2.2”条件进样测定峰面积，计算槲皮素、EGCG含量。见表3。

表3 槲皮素和EGCG含量

3 讨论

文冠木是蒙古族习用药材，广泛运用于临床中，体现在消炎镇痛、提高免疫力、增强记忆力、活血等方面，但对质量控制研究的方法相对较少。本实验通过提取文冠木黄酮类有效成分，经多次预实验，确立水-乙醇梯度洗脱，建立完善质量标准研究[22]，最终确定流动相：乙腈－水，才得到槲皮素和EGCG较好的峰形。HPLC法测定结果显示文冠木提取工艺稳定可靠，质量控制简便、可操作性强。

现代药理表明，槲皮素可能通过下调Bcl2及上调Bax因子的表达，降低Bcl2/Bax比值，诱导脑胶质瘤细胞凋亡[23]，抑制癌细胞增殖和诱导细胞凋亡。槲皮素可通过抑制核因子-κB激活，减少炎性环境中软骨细胞内基质金属蛋白酶-13的产生、加快基质降解，促炎细胞凋亡，起到保护软骨的作用[23]；EGCG有抗氧化、抗肿瘤、保护神经系统、保护心脑血管、抑菌、干预代谢酶等作用[24]，能显著提高RA患者体内CD19、白细胞介素-10、Breg在淋巴细胞内占比，且与记忆B细胞和浆母细胞总和的比值升高有关[25]。由此，二者均对RA有一定的疗效。

文冠木中槲皮素和EGCG含量可观，为文冠木的临床研究明确了方向。随着文冠木化学成分及药理活性的不断被发掘被证实，文冠木作为一种具有发展前景的蒙古族药，还需不断深入研究，规范用药指导，使单药在治疗RA中将起到不可估量的作用。