HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者HBV MHR外变异临床意义

2021-04-24顾超章晓鹰孙学华张珏高月求

分子诊断与治疗杂志 2021年3期

顾超章晓鹰★ 孙学华张珏高月求

乙型肝炎肝病毒（hepatitis B virus，HBV）e 抗原（HBeAg）为病毒复制标志，HBeAg 转阴代表了慢性感染的免疫控制，被称为是乙型肝炎病毒感染自然史中的里程碑［1-2］。非活动性乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）携带者预示着较好的临床转归预后。然而部分非活动性HBsAg 可产生HBV 再复制，发展为HBeAg 阴性慢性乙型肝炎［3］，治愈难，预后较差，与肝癌、肝硬化的发生具有较大关联［2，4］。HBV 的感染史取决于病毒、宿主和环境之间的相互作用［5］。HBV S 蛋白即为俗称的HBsAg或澳大利亚抗原，S 蛋白分为主要亲水区（major hydrophilic region，MHR）与MHR 外两部分，由226个氨基酸组成。MHR 区为B 细胞表位（“a”决定簇位于此区域），MHR 外区包含细胞毒T 淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL）和辅助T 细胞（T-helper，Th）免疫表位区（CTL+Th 免疫表位区）与非免疫表位区［6-8］，在刺激宿主相关的免疫功能中扮演重要角色［9］。本实验前期研究发现：经历HBeAg 血清学转换后，HBV S 蛋白的MHR 外出现明显变异，且此区域变异在HBeAg 阴性慢性乙型肝炎组达峰值［10］。本研究进一步分析HBeAg 阴性慢性乙型肝炎患者HBV MHR 外免疫表位区与非免疫表位区变异特征，同时探讨变异临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2019年3月至2019年12月本院东院肝炎科门诊或住院慢性乙肝患者154 例。依据2019版《慢性乙型肝炎防治指南》［5］，分为非活动性HBsAg携带状态组55 例，其中男性32 例，女性23 例，平均年龄（38.80±9.90）岁，B 基因型34 例，C 基因型21 例；HBeAg 阴性慢性乙型肝炎组99 例，男性57例，女性42 例，平均年龄（43.23±10.56）岁，B 基因型50 例，C 基因型49 例。两组基因型与性别无关，差异无统计学意义（P＞0.05）。本实验经本院伦理委员会审批通过，所有患者均知情并同意。

纳入标准：①非活动性HBsAg 携带状态组：HBsAg 阳性、HBeAg 阴性、抗HBeAb 阳性，HBVDNA＜2 000IU/mL，丙氨酸氨基转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）与天门冬氨酸氨基转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）正常；②HBeAg阴性慢性乙肝组：HBsAg 阳性、HBeAg 阴性、抗HBeAb 阳性，ALT 持续或反复异常，HBV-DNA＞2 000 IU/mL。以上所有患者均有抗病毒药物治疗史。排除标准：排除合并其它病毒感染。

1.2 方法

1.2.1 试剂/仪器

DNA 提取试剂盒与DNA 第一次纯化试剂盒（购自德国QIAGEN 公司），DNA 第二次纯化试剂盒（购自美国Applied Biosystems 公司），基因分析仪3500DX（购自美国Applied Biosystems 公司）。

1.2.2 HBV-DNA S 区基因测序

患者血浆（EDTA 抗凝管）200 μL 用于核酸提取，按操作说明书进行操作。按Genbank HBVDNA（HBV genotype B DNA，complete genome，LC036263；HBV genotype C DNA，complete genome，AB644286）的S 基因序列，利用Primer Primer 5.0 设计引物（表1）。二者均涵盖整、MHR 区域与MHR 外区域。

表1 HBV-DNA S 区引物序列Table 1 Primer sequence of HBV-DNA S region

HBV-DNA 核酸提取后分别进行PCR 第一轮扩增与纯化，获得的PCR 产物进行测序PCR 扩增与纯化，纯化后的测序PCR 产物直接加入10μL 的去离子甲酰胺（Hi-Di Formamide），短时振荡溶解DNA，95℃变性5 min，迅速置于冰上或4℃冷却4 min，3500 DX 基因分析仪上样测序。利用Primer Primer 5.0 将核苷酸序列翻译成氨基酸序列，BLAST 分析软件进行氨基酸序列比对。见表2。

表2 PCR 反应体系Table 2 PCR reaction system

1.3 统计学方法

利用SPSS 16.0 统计软件，计数资料用n（%）表示，采用χ2检验；非正态分布采用中位数（M）［四分位数（P25～P75）］表示，两组间比较采用非参数Mann-WhitneyU检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组HBV MHR 与MHR 外各区域变异比较

HBeAg 阴性慢性乙型肝炎组MHR 外总体变异率显著高于非活动性HBsAg 携带组，差异有统计学意义（P＜0.05）。MHR 外的变异差异主要来自CTL+Th 免疫表位区，CTL+Th 免疫表位区的HBeAg 阴性慢性乙型肝炎组变异率显著高于非活动性HBsAg 携带组，差异有统计学意义（P＜0.01）。此外，MHR 与其区域内的“a”决定簇变异率两组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 两组HBV MHR 与MHR 外各区域变异比较［n（%）］Table 3 Comparison of variation in HBV MHR and other regions between the two groups［n（%）］

2.2 两组HBV MHR 与MHR 外各区域热点变异位点比较

MHR 与“a”决定簇热点变异位点为T/I126/T/S/A，此位点在HBeAg 阴性慢性乙型肝炎组变异频次为16.16%，高于非活动性HBsAg 携带组，差异无统计学意义（P＞0.05）。MHR 外CTL+Th 免疫表位区热点变异位点在非活动性HBsAg 携带组是F220L，在HBeAg 阴性慢性乙型肝炎组是L21S；MHR 外非免疫表位区两组均为I68T/N。HBeAg 阴性慢性乙型肝炎组MHR 外总体变异频次为17.17%，高于非活动性HBsAg 携带组，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

3 讨论

非活动性HBsAg 携带状态者约20%～30%会出现病毒再复制，成为HBeAg 阴性慢性乙型肝炎［3］。非活动性HBsAg 携带者通常血清中HBVDNA 低于检测限或接近检测限，但低于检测限患者无法进行病毒DNA 测序。因此，本研究选取HBV DNA＜2000 IU/mL 患者为非活动性HBsAg 携带组观察对象。结果显示非活动性HBsAg 携带者MHR 外总体变异率明显低于HBeAg 阴性慢性乙型肝炎患者，其变异主要出现在CTL+Th 免疫表位区，并使HBeAg 阴性慢性乙型肝炎发生概率增加2 倍以上。相关研究表明，CTL、Th 细胞介导的细胞免疫相较B 淋巴细胞介导的体液免疫，在病毒清除过程中具有更主导、更关键性作用［11］，如果CTL+Th 免疫表位区出现变异可影响患者的细胞免疫功能［7］。HBV 变异可以自然产生，但大部分是由免疫压力所致［12］。我们的前期研究也证实：MHR 外变异主要出现在血清学转换后［10］，而血清学转化主要发生在免疫清除期［13］，由此推测：病毒在血清学转换过程中强大的免疫压力之下，HBV MHR 外区以及与位于该区域的CTL+Th 免疫表位区产生变异，导致细胞免疫逃逸，这可能是病毒再复制与感染持续的原因之一。国外研究报道多集中在对于HBV MHR 区域研究，认为该区域变异与疫苗免疫逃逸以及抗体检测逃逸有关［6］，如T/I126/T/S/A 与疫苗免疫逃逸有关［14］，并报道MHR 变异与基因型、病毒持续感染以及抗病毒治疗有关［15］，而对于HBV S 蛋白尤其是MHR 外变异的研究非常少，目前未查见MHR 外变异与乙肝复发相关性报道。本研究并未发现T/I126/T/S/A位点与病毒再复制有关，而其它热点变异位点如L21S、F220L 与I68T/N 尚未见相关报道，这可能是由于这些位点位于MHR 外，而MHR 外区域的相关研究报道较少。