OPN基因多态性与潮汕人群女性SLE发病风险的相关性

陈新瑶 丁燕佳 梁雪雁 黄慧莹 韦华贵 王俊利 林敏

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种累及多器官、多系统、临床表现复杂且病程反复的自身免疫性疾病。相关文献报道SLE 发病机制是某些环境因素作用于一定遗传背景的机体引发自身免疫调节失衡而致［1］。骨桥蛋白（osteopontin，OPN）是一种细胞外基质磷酸化糖蛋白，在细胞表面与其受体结合并诱导细胞信号转化，促进细胞的黏附和迁移，在免疫系统的疾病进程中发挥着重要的调节作用［2］。OPN 也称为早期T1 型淋巴细胞因子，由多种免疫细胞产生并在人体的骨、肾、脑等多种组织中表达。近年研究发现，OPN 参与了免疫炎症、肿瘤细胞凋亡等［3］。目前OPN基因多态性与SLE 发病风险的报道仍较为少见，研究表明，OPN 在SLE 中高表达［4-5］。李兴锐等［6］报道提示研究基因的多态性与人类特殊疾病的关联性具有重大的意义。本课题将探究OPN基因多态性rs1126772、rs11728697和rs4754位点与女性SLE 患者发病风险的相关性，为潮汕地区女性SLE 患者的预防和治疗提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 病例来源

选取2018年1月至2019年12月汕头大学医学院附属潮州市人民医院以及汕头大学医学院第一附属医院就诊的59 例SLE 女性患者作为研究组，平均年龄（38.05±8.45）岁。纳入标准：①所有病例均符合《2019 欧洲抗风湿病联盟/美国风湿病学会系统性红斑狼疮分类标准发布》［7］；②通过身份证信息及询问确认患者和健康对照人群均为潮汕人，居住在中国潮州的同一地理区域。排除标准：①结缔组织疾病；②血液系统疾病；③感染性疾病；④恶性肿瘤。在同一时期招募94 名年龄匹配的女性作为对照组，平均年龄（44.66±7.13）岁。两组年龄比较差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究已获得本院伦理委员会批准，所有患者均签订知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA 提取

采用EDTA-K2 抗凝真空管采集受试者外周血2 mL，按照血液基因组DNA 提取试剂盒（DP348）（天根生化科技有限公司，北京）操作说明书提取人外周血白细胞基因组DNA。采用全波长酶标仪Multiskan GO（赛默飞世尔科技，德国）测定DNA 浓度，-70℃保存备用。

1.2.2 引物设计及反应体系

根据NCBI 的OPN基因参考序列NC_000004.12，采用LightScanner 引物设计软件（Idaho Technology Idaho Technology，美国）设计高分辨率熔解曲线（High Resolution Melting，HRM）的引物（表1）所有引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。PCR 反应体系为：扩增体系为20 μL，其中包括基因组DNA 100 ng，100 μmol/L dNTPs，上下游引物各0.2 μM，1 μL LC Green plus，4 μL 5 × PCR buffer，0.5 U HotStar TaqDNA聚合酶，纯净水9.2 μL。在LifeTouch 基因扩增仪TC-96（博日科技，杭州）进行反应，反应条件为：94℃预变性3 min；94℃变性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸15 s，35个循环。

1.2.3 SNP 的基因分型

PCR 扩增结束后，使用LightScanner 96 分析仪对产物进行基因分型，在70℃～95℃范围内收集荧光信号并绘制熔解曲线，采用已测序验证的DNA 作为标准品，熔解温度相同的归为同一基因型。将本实验中三个位点的HRM 分型结果统计分类后，抽取部分样本采用同样的引物进行测序验证。

1.2.4 基因测序验证

根据NCBI 的OPN基因参考序列NC_000004.12和SNP 位点，采用Primer Premier 5.0 软件设计测序引物（表1）。扩增体系为50 μL，其中包括基因组DNA 100 ng，200 μmol/L dNTPs，2.0 mmol/L MgCL2，上下游引物各1 μmol/L，2.5 U Taq DNA聚合酶，5 μL 10 × PCR buffer，纯净水36 μL。反应条件为：94℃预变性3 min；94℃变性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸15 s，35 个循环。扩增结束后用2%的琼脂糖凝胶电泳对产物进行鉴定，纯化，使用ABI3730 双向测序，与标准序列比对查找突变点。

1.3 统计学分析

采用SPSS 20.0 软件包进行统计分析。Logistic 回归分析影响SLE 临床症状的SNP 分型危险因素；计数资料以n（%）表示，行χ2检验，采用χ2检验以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 熔解曲线分型与测序验证

测序结果与HRM分型结果100%一致。见图1～3。

2.2 两组OPN 基因SNP 比较

研究组和对照组的OPN rs1126772、rs11728697及rs4754位点的基因频率均符合群体基因遗传平衡（P＞0.05）。研究组和对照组rs1126772、rs11728697及rs4754基因型分布频率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表1 OPN 基因三个SNP 的HRM 引物及测序引物Table 1 HRM primers and Sequencing primers of 3 SNPs of OPN gene

图1 高分辨率熔解曲线和PCR-Sanger 测序分析OPN_rs1126772 位点基因型的结果Figure 1 High Resolution Melting curves and PCR-Sanger sequencing result of OPN_rs1126772 genotyping

图2 高分辨熔解曲线和PCR-Sanger 测序分析OPN_rs11728697位点基因型的结果Figure 2 High Resolution Melting curves and PCR-Sanger sequencing result of OPN_rs11728697 genotyping

图3 高分辨率熔解曲线和PCR-Sanger 测序分析OPN_rs4754 位点基因型的结果Figure 3 High Resolution Melting curves and PCR-Sanger sequencing result of OPN_rs4754 genotyping

2.3 OPN 基因SNPs 与SLE 关联性

59 例SLE 患者的临床表型：狼疮性肾炎24例、蝶形红斑11 例、关节炎13 例、血液系统病变18例、神经系统病变7 例，其中15 例合并2 种及以上临床并发症。通过分析，OPN基因rs1126772、rs11728697及rs4754位点与SLE 患者的临床表型差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

3 讨论

目前我国估计超过100 万SLE 患者，而女性SLE 患者发病率高达113/10 万人，且有逐年递增的趋势［8］。SLE 发病机制复杂，多种遗传基因与SLE关联密切［6，9］，因此探索与SLE 发病风险相关的基因是目前研究其发病机制的热点之一。李星军等［10］报道SLE 患者白细胞免疫球蛋白样受体LILRA2基因多态性位点（rs2241524）（G＞A）与SLE 的发病风险相关。吴成将等［11］研究表明CD40基因多态性会增加SLE 患者的易感性并且与患者病情有关。董鑫等［12］研究指出Fcγ 受体基因rs396991A/C位点基因多态性与SLE 易感性有关，携带其AA、AC基因型的SLE 患者分别更易出现血液、肾脏系统受累。本课题所研究的OPN基因是目前已知与SLE易感性相关的关键基因之一，此前已有多项研究表明其二者之间的关联性。Forton 等［13］发现SLE 患者和正常对照人群OPN基因的多态性与该病存在显著的相关性，提示OPN基因的多态性可能在SLE 的发病中发挥着重要的作用。Kaleta 等［14］的研究表明，OPN_rs1126616的杂合或纯合突变（707C/T）的个体具有更高的SLE 易感性。石凤等［15］研究指出OPN rs2853750可能是SLE 女性患者并发关节炎的易感位点。对于OPN基因影响SLE 的作用机制也被广泛研究：OPN 水平增加与SLE 疾病活动指数（SLEDAI：Disease Activity Index）呈正相关［16］。直至目前为止，未发现有报道OPN基因rs1126772、rs11728697及rs4754位点与SLE 易感性相关的研究，本课题填补了这一研究方向的空白，为后续的研究提供参考和依据。

值得关注的是，此前一项研究提示，合并肾炎的SLE 患者OPN 的表达水平高于非肾炎组［17］。本研究收集的SLE 病例样本在临床表型中合并狼疮性肾炎的病例不在少数，回归分析结果表明OPN基因上述三个位点可能与狼疮性肾炎表型不具有相关性。本研究尚有几方面不足：首先，由于本研究只选取了OPN基因中的3 个SNPs，而且只局限于潮汕地区人群；其次，收集的样本病例数较少且只收集单一性别女性患者标本，研究结果可能不具有广泛的代表性。因此，OPN基因更多相关位点以及不同性别人群与SLE 是否存在相关性尚待扩大区域以及增加实验样本数量进行深入的综合分析，以期更进一步发现OPN基因的多态性与SLE 发病风险的相关性，为该病的发病机制寻求更多的有效信息和有力的理论依据。此外，本研究的另一个限制是没有测量血浆OPN 浓度，这可能成为最终结论更有力的支持，并且可能与OPN基因型依赖性差异相关。综上所述，SLE 疾病复杂多变，本研究从OPN基因多态性阐述了SLE 与健康人群的疾病易感性差异，为进一步从分子水平更深入研究其发病机制提供了思路。

表2 OPN SNPs 位点在研究组与对照组的基因型分布频率［（n，%）］Table 2 Genotypes distribution frequency of OPN SNP sites in both research group and control group［（n，%）］

表3 OPN 基因rs1126772、rs11728697 和rs4754 位点与SLE 患者临床表型的相关性［（n，%）］Table 3 Correlation between rs1126772，rs11728697 and rs4754 of OPN gene and the clinical phenotype of SLE patients［（n，%）］