五指毛桃对小鼠酒精性肝损伤的保护作用

张 茹，杜 娟

(哈尔滨商业大学 药学院，哈尔滨 150076)

五指毛桃为桑科(Moraceae)榕属(Ficus)植物粗叶榕(FicushirtaVahl)的干燥根[1]，主要分布于我国南部及西南部地区，其根、果均可入药.传统中医认为，五指毛桃具有健脾补气、化湿行气、舒筋活络等功效.近年来研究发现，五指毛桃中含有苯丙素类、黄酮类、萜类、甾醇类及挥发油类等多种类型的化合物[2].有研究表明，五指毛桃对毒品可卡因所致的肝毒性、二甲基甲酰胺所致的急性肝损伤及拘束应激性肝损伤等均具有优良的肝保护作用[3-5].有关五指毛桃对酒精性肝损伤保护作用的研究还相对较少，本文旨在通过复制小鼠醉酒模型，以五指毛桃提取液为实验药物，以葛花为阳性对照，考察五指毛桃对酒精性肝损伤实验中小鼠的干预保护作用.

1 材料与方法

1.1 实验动物

ICR雄性小鼠，体重18～22 g，长春市亿斯实验动物有限公司提供，动物许可证号：STK(吉2018-0007).

1.2 材料与试剂

五指毛桃购自广东省河源市、葛花购自黑龙江省哈尔滨市中药市场，经中药教研室张翠教授鉴定为正品.56度牛栏山二锅头，北京顺鑫农业股份有限公司牛栏山酒厂.超氧化物歧化酶(SOD)、还原谷胱甘肽(GSH)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、核转录因子-κB(NF-κB)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所.

1.3 仪器与设备

XZC-1型小鼠自主活动测定仪、722型紫外-可见光分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)、多功能酶标仪(北京赛多利斯仪器系统有限公司).

1.4 实验方法

1.4.1 药物的制备

1)葛花提取液的制备

称取葛花，料液比1∶10，水中浸泡1 h后煎煮.煮沸后改文火煮1 h，倾出煎液加10倍量水继续煎煮1 h.合并两次滤液，将滤液浓缩为2 g/mL浓缩液，密封，放入冰箱4 ℃冷藏备用.

2)五指毛桃提取液的制备

称取五指毛桃，加入10倍量水，水中浸泡1 h后煎煮.煮沸后改文火煮1 h ，倾出煎液加10倍量水继续煎煮1 h.合并两次滤液，将滤液浓缩为2 g/mL 浓缩液，密封，放入冰箱 4 ℃冷藏备用.

1.4.2 分组及给药

将小鼠适应性饲养1周后，随机分为空白对照组、模型对照组、葛花组、五指毛桃低、中、高剂量组.葛花组按0.53 g/(kg·d)剂量灌胃葛花提取液；五指毛桃低、中、高剂量组按0.2 g/(kg·d)、0.4 g/(kg·d)、0.6 g/(kg·d)剂量灌胃五指毛桃提取液；空白对照组和模型对照组灌胃等量0.9 %生理盐水.30 min后，除空白对照组外，剂量组和模型对照组分别按剂量10 mL/kg 灌胃牛栏山二锅头(56%乙醇)，连续灌胃10天，空白对照组灌胃等量蒸馏水.给药剂量参考文献[6-8]和预实验确定.各组均常规饮水和喂食.每日灌胃前称量记录小鼠体质量.末次给药2 h后进行标本采集.

1.4.3 自主活动试验

将灌酒后的小鼠放入自主活动仪内，适应5 min.然后开始记录小鼠在自主活动箱5 min内穿越格子的数量，作为小鼠自主活动次数.

1.4.4 肝脏标本采集及检测

处死小鼠，剖腹取小鼠肝脏组织，放入预冷的生理性盐水中快速漂洗去除血迹，滤纸吸干肝组织的生理盐水，擦拭后称重，计算肝脏指数，肝脏指数=完整肝脏湿重/体质量×100%.按照组织质量:生理盐水体积比为1∶9的比例加入生理盐水，手动研磨制成10%肝组织匀浆.分别测定肝匀浆组织中GSH含量及SOD活性.采用ELISA法检测肝组织中IL-6、IL-1β、TNF-α和 NF-κB水平.采用考马斯亮蓝法测定蛋白质.

1.5 统计学处理

2 实验结果

2.1 各组小鼠体质量变化

与造模前相比，各组小鼠体质量并无显著性差异(P>0.05).结果见表1.

表1 各组小鼠体质量变化

2.2 各组小鼠自主活动变化

与空白对照组相比，模型对照组的自主活动次数明显增加(P<0.05)；与模型对照组相比，五指毛桃各剂量组小鼠的自主活动次数有所减少，但差异无明显统计学意义(P>0.05)；与葛花组相比，五指毛桃高剂量组小鼠自主活动次数减少，但差异无明显统计学意义(P>0.05).结果见表2.

表2 各组小鼠自主活动变化

2.3 各组小鼠肝脏指数变化

与空白对照组相比，模型组的肝脏指数升高(P<0.05)，说明造模成功，五指毛桃低、中剂量组肝脏指数与空白对照组相接近，两者差异无明显统计学意义(P>0.05)；与模型对照组相比，各组动物肝脏指数均有所下降，其中，五指毛桃低剂量组的肝脏指数明显低于模型组(P<0.05)；与葛花组相比，五指毛桃低、中剂量组的肝脏指数低于葛花组，两者差异无明显统计学意义(P>0.05).结果见表3.

表3 各组小鼠肝脏指数变化

2.4 各组小鼠肝组织中GSH含量及SOD活性变化

2.4.1 各组小鼠肝组织中GSH含量变化

与空白对照组相比，模型组GSH含量显著降低(P<0.05)，说明造模成功；与模型对照组相比，五指毛桃各剂量组GSH含量虽有所升高，但没有显著性差异(P>0.05)；与葛花组相比，五指毛桃各剂量组GSH含量有所降低，但没有显著性差异(P>0.05).结果见表4.

2.4.2 各组小鼠肝组织中SOD活性变化

与空白对照组相比，模型对照组SOD活性显著降低(P<0.05)，说明造模成功；与模型对照组相比，五指毛桃中、高剂量组SOD活性显著升高(P<0.05)，五指毛桃低剂量组SOD活性虽有所升高，但没有显著性差异(P>0.05).与葛花组相比，五指毛桃中、高剂量组SOD活性显著升高(P<0.05).SOD活性随五指毛桃剂量的增加而升高.结果见表4.

表4 各组小鼠肝组织中GSH含量及SOD活性变化

2.5 各组小鼠肝组织中IL-6、IL-1β、TNF-α及NF-κB水平变化

2.5.1 各组小鼠肝组织中IL-6水平变化

与空白对照组相比，模型对照组IL-6水平显著升高(P<0.05)，说明造模成功；与模型对照组相比，五指毛桃中剂量组IL-6水平显著降低(P<0.05)，五指毛桃高、低剂量组IL-6水平虽有所降低但无显著性差异(P>0.05)；与葛花组相比，五指毛桃各剂量组IL-6水平有所升高，但无显著性差异(P>0.05).结果见表5.

2.5.2 各组小鼠肝组织中IL-1β水平变化

与空白对照组相比，模型对照组IL-1β水平显著升高(P<0.05)，说明造模成功；与模型对照组相比，五指毛桃高、中剂量组IL-1β水平显著降低(P<0.05)，五指毛桃低剂量组IL-1β水平虽有所降低但无显著性差异(P>0.05)；与葛花组相比，五指毛桃高剂量组IL-1β水平有所降低但无显著性差异(P>0.05).IL-1β水平随五指毛桃剂量的增加而降低.结果见表5.

2.5.3 各组小鼠肝组织中TNF-α水平变化

与空白对照组相比，模型对照组TNF-α水平显著升高(P<0.05)，说明造模成功；与模型对照组相比，五指毛桃高、中剂量组TNF-α水平显著降低(P<0.05)，五指毛桃低剂量组TNF-α水平虽有所降低但无显著性差异(P>0.05)；与葛花组相比，五指毛桃高、中剂量组TNF-α水平有所升高但无显著性差异(P>0.05).结果见表5.

2.5.4 各组小鼠肝组织中NF-κB水平变化

与空白对照组相比，模型对照组NF-κB水平显著升高(P<0.05)，说明造模成功；与模型对照组相比，五指毛桃高剂量组NF-κB水平显著降低(P<0.05).与葛花组相比，五指毛桃组NF-κB水平有所升高但无显著性差异(P>0.05).结果见表5.

表5 各组小鼠肝组织中IL-6、IL-1β、TNF-α、NF-κB水平变化

3 讨 论

中医学中对饮酒伤肝的认识和论述已有悠久的历史，如文献记载为“胁痛”“酒疸”“伤酒”“酒癖”“酒臌”等证候名[9].中医学认为，酒为水谷之精，乃大热之品.《本草纲目》记载: “酒…苦、甘、辛、大热、有毒；行药势，通血脉，润皮肤，散湿气，除风下气；少饮则和血行气，多饮则杀人顷刻”[10].过量饮酒可导致脏腑功能失调，出现肝脏的损伤，其基本病因、病机为脾虚血瘀[11]，酒乃湿热之邪，酒热藏匿于血分，气血津液被扰，从而出现气滞、血瘀、痰凝等病理因素的蕴积；湿气属阴，易伤脾气，脾的运化功能失常，使气血生化不足，出现脾肾亏虚；热邪属阳，伤及肝阴，肝虚及肾，从而出现肝脾肾三脏及气血阴阳的虚损[12-13].现代研究表明，酒精在肝脏氧化，其代谢过程会利用氧化应激诱发大量自由基生成，从而引起机体功能紊乱，造成多系统损伤.正常肝组织内存在多种抗氧化物质，其中GSH、SOD的水平是反映酒精性肝损伤时肝脏清除自由基能力和抗氧化能力的重要指标，在抵抗酒精所致的肝损伤中起到关键作用[14]，提高SOD和GSH的活性，清除肝细胞中的自由基可以有效减轻酒精对机体的损伤.酒精引起的氧化损伤还可以继发性激活肝脏炎症反应，导致释放大量细胞因子和炎症介质[15].NF-κB是一种多功能核转录因子，氧化应激和促炎性细胞因子能够快速短暂激活NF-κB[16]，TNF-α、IL-6和IL-1β是NF-κB的经典激活途径中的靶点，与NF-κB结合使其被激活，介导肝组织变性、坏死，从而出现酒精性肝病[17-19].

现代研究提示，五指毛桃对化学性肝损伤，如急性CCl4肝损伤、二甲基甲酰胺所致肝损伤等具有保护作用[5,20].而葛花可有效减少由乙醇引起的肝细胞损伤[21-22].本实验发现，五指毛桃提取物可明显升高GSH含量及SOD活力，说明五指毛桃具有一定的抗氧化能力，可以通过增加GSH含量、提高SOD活性来减轻酒精对机体的损伤，对于酒精性肝损伤具有一定的保护作用.此外，五指毛桃提取物可使肝组织中炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α、NF-κB水平下降，这可能与其主要活性成分香豆素类化合物、黄酮类化合物有关.五指毛桃富含较多类黄酮类成分，黄酮类化合物具有丰富的药理活性如抗肿瘤、抗氧化、抗菌、抗病毒及抗凝血等[23-24]；香豆素类化合物在五指毛桃中广泛存在，是其主要活性成分，也是最早从中分离到的一类活性成分，其中补骨脂素及佛手柑内酯已成为五指毛桃指标成分群中最有价值的质量评价指标[2].因此，可以从五指毛桃保护肝损伤的有效成分及其作用机理进一步深入研究，为五指毛桃的开发和利用提供理论基础.