急性胆道感染患者胆汁培养分离致病菌菌种与药物敏感性分析

魏田利，周立雪，张苗苗，祝天阳，段 宁，肖 楠，赵秀英

(清华大学附属北京清华长庚医院·清华大学临床医学院 检验科,北京102218)

急性胆道感染是消化系统常见的急危重症，主要包括急性胆囊炎和急性胆管炎，多与胆石症共同存在，互为因果，严重时会导致多个器官功能受损，危及生命[1]。因此，规范急性胆道感染的诊断和治疗，减少急性胆道感染不良事件的发生，具有重要意义。目前，对急性胆道感染的治疗一般是经验性用药，国内不同地区、不同医院引起胆道感染的致病菌存在差异，且对抗菌药物的敏感性亦各具特点[2]，了解引起胆道感染的主要致病菌种类及其耐药状况，对临床经验性治疗胆道感染时选择抗菌药物具有重要意义。本研究回顾性分析了本院近5年所收治的急性胆道感染患者的胆汁培养病原菌及药敏试验结果，以期为临床合理选用抗菌药物提供参考。

1 材料与方法

1.1 标本

回顾性分析2015年1月-2019年12月在清华长庚医院肝胆外科住院的确诊并有完整病原学资料的急性胆道感染患者共189例，其中男性98例，女性91例；年龄范围20-93岁，平均年龄为(60.1±16.4)岁。其中感染伴发结石的患者总共有135例，男性70例，女性65例。纳入标准：符合中华医学会外科学分会胆道外科学组急性胆道系统感染的诊断和治疗指南(2011年版)所规定的胆道感染标准[3]。

1.2 试剂与仪器

培养基：血平板，麦康凯平板，沙保罗平板，水解酪蛋白琼脂(M-H)平板。鉴定和药敏：VITEK-2 Compact 全自动细菌鉴定与药敏仪配套的GN阴性菌鉴定卡、GP阳性菌鉴定卡、AST药敏卡，纸片扩散法(K-B法)药敏纸片。主要仪器设备：接种用具，比浊仪，二氧化碳培养箱，真菌培养箱，生物安全柜，显微镜，VITEK-2 Compact 全自动细菌鉴定与药敏仪(bioMerieux，VITEK-2 Compact 60)，Bruker全自动快速生物质谱仪(Bruker，Microflex LT)。

1.3 质控菌株

霍氏肠杆菌ATCC700323、宋内志贺菌ATCC25931、肺炎链球菌ATCC49619、腐生葡萄球菌ATCCBAA750、大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、金黄色葡萄球菌ATCC29213、粪肠球菌ATCC29212。

1.4 实验方法

标本采集由经验丰富的医师进行，术前各项设备及仪器都经严格消毒，术中穿刺留取胆汁3-5 mL注入无菌培养管中，立即送本院微生物室进行接种。培养：严格依据《全国临床检验操作规程》[4]，将送检标本接种于血平板、麦康凯平板或沙保罗平板，放于35℃ 二氧化碳培养箱或真菌培养箱进行培养。鉴定：挑取纯的单个菌落，主要采用VITEK-2 Compact全自动细菌鉴定与药敏仪进行鉴定，补充方法采用Bruker全自动快速生物质谱仪鉴定。药敏试验：主要采用VITEK-2 Compact全自动细菌鉴定与药敏仪进行药敏试验，补充采用纸片扩散法(K-B法)做头孢哌酮/舒巴坦的药敏试验。药物敏感试验结果按美国临床实验室标准化研究所(CLSI)标准判读[5]。数据采用SPSS16.0 软件进行统计分析，剔除重复菌株，对同一患者多次分离到同一种细菌者仅纳入首次分离株。

2 结果

2.1 一般资料

2015年1月-2019年12月肝胆外科急性胆道感染患者共189例，送检的胆汁培养阳性150例，阳性率79.4%，其中有51.3%(77/150)的病例为混合感染(胆汁培养出2种及以上致病菌)。189例住院患者中，男性98例，女性91例，培养的阳性率分别为83.7%(82/98)和74.7%(68/91)。

2.2 胆汁培养病原菌分布

从培养阳性的胆汁中共分离出298株致病菌，半数的分离致病菌为肠杆菌科细菌占50%(149/298)，肠球菌属占第二位为24.8%(74/298)，非发酵菌属占第三位为13.1%(39/298)，其他还包括弧菌与气单胞菌属，葡萄球菌属和真菌等，值得注意的是还分离出3株专性厌氧菌(分别为变形梭杆菌，产气荚膜梭菌，放线菌)。菌属构成比见表1。298株致病菌中革兰阴性菌207株，占69.5%；革兰阳性菌84株，占28.2%；真菌7株，占2.3%。引起胆道感染的革兰阴性菌主要是大肠埃希菌，肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌，占阴性菌的66.2%(137/207)；革兰阳性菌主要是粪肠球菌和屎肠球菌，占阳性菌的64.3%(54/84)；真菌均为念珠菌，以白色念珠菌(57.1%)多见。298株致病菌中排名前5位的致病菌依次为大肠埃希菌68株(22.8%)，肺炎克雷伯菌44株(14.8%)，屎肠球菌36株(12.1%)，铜绿假单胞菌25株(8.4%)，粪肠球菌18株(6.0%)。病原菌分布与构成见表2。

2.3 感染与伴发结石的分析

189例急性胆道感染患者中伴发结石的有135例，占总例数的71.4%，胆汁培养阳性106例，阳性率78.5%。不伴发结石的胆道感染患者54例，培养阳性44例，胆汁培养阳性率81.4%，两组比较无统计学意义(P>0.05)。两组的胆汁培养病原菌排在前5位的依次是大肠埃希菌，肺炎克雷伯菌，屎肠球菌，铜绿假单胞菌，粪肠球菌。

2.4 致病菌耐药表型分析

分析主要致病菌的耐药表型：大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)检出率分别为60.3%(41/68)和47.7%(21/44)，占所有肠杆菌科细菌的41.6%(62/149)。检出耐碳青霉烯酶(CRE)的大肠埃希菌3株和肺炎克雷伯菌5株，占所有肠杆菌科细菌的5.4%(8/149)。检出耐碳青霉烯酶的铜绿假单胞菌(CRPA)5株，占所有铜绿假单胞菌的20%(5/25)。耐万古霉素的屎肠球菌(VRE)检出1株。

2.5 药敏试验结果

对大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，头孢菌素类药物两者都以头孢替坦敏感性最优；从β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂复合制剂来看，哌拉西林/他唑巴坦的抑菌活性最优，耐药率分别为5.9%和13.6%，其次是头孢哌酮/舒巴坦。对于肺炎克雷伯菌，喹诺酮类抗生素的抑菌活性好于大肠埃希菌。碳青霉烯类抗生素对两者都表现出较好的抑菌活性，不同的是，相对于大肠埃希菌，肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素的耐药率稍高。大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素的耐药率分别为4.4%和11.4%。胆汁分离的非发酵菌以铜绿假单胞菌最为多见。铜绿假单胞菌对常见抗生素普遍敏感，对氨基糖苷类药物、喹诺酮类药物的体外测试均全部敏感。对头孢类药物和碳青霉烯类药物的耐药率均低于25%。详见表3。

对青霉素类和左氧氟沙星药物的耐药率，屎肠球菌普遍高于粪肠球菌。对两种肠球菌敏感性都较好的是万古霉素和利奈唑胺，检出耐万古霉素的屎肠球菌1株，未检出耐万古霉素的粪肠球菌。屎肠球菌和粪肠球菌均未检出对利奈唑胺耐药。详见表4。

3 讨论

一般情况下，正常人的胆汁是无菌的，但是由于胆汁流通路径均为细长型管道，其解剖位置、结构特点及生理特性使其极易发生感染。众多因素可引起急性胆道感染，如各种因素造成的胆道梗阻、胆道损伤等。胆石症与胆道感染的关系极为密切，二者互为因果，相互作用。胆道感染患者中60%-70%患有胆石症[6]，主要原因是结石易引起胆汁排泄不畅，进而导致肠道内细菌逆行至胆道系统，当侵入胆道的病原菌在胆道内异常增殖时则可引起胆道感染[7]。本研究中，189例急性胆道感染患者中伴发结石的有135例，占总例数的71.4%，与往年数据基本接近，胆汁培养阳性率78.5%；但是不伴发结石的急性胆道感染患者胆汁培养阳性率81.4%，略高于伴发结石组，这与武志熊等人的研究报道相一致[8]。急性非结石性胆道感染的病因和发病机制尚不完全明确，包括解剖性和功能性因素引起的胆囊缺血、胆汁排泄障碍和继发细菌感染[9]。

表4 胆汁培养主要革兰阳性菌对常用抗菌药物的耐药情况

有研究显示，胆汁细菌培养阳性率为22.6%-75.1%，差异较大[10]。本研究所选样本为本院近5年肝胆外科急性胆道感染患者，送检的胆汁细菌培养阳性率为79.4%，培养阳性率较其他报道偏高[11]。由于胆道与肠道相通，胆道感染时致病菌主要来自于肠道细菌的逆行性感染，因而胆汁中分离所得致病菌谱与肠道内正常菌谱大致吻合[12]，革兰阴性菌以大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌等为主，革兰阳性菌以粪肠球菌、屎肠球菌等为主[13]，与以往研究结果相似。

本研究数据表明，急性胆道感染分离致病菌主要以革兰阴性细菌为主，占69.5%，提示对临床怀疑急性胆道感染的患者，经验用药宜选用针对革兰阴性细菌者。革兰阴性菌中，主要构成是大肠埃希菌，肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌，占阴性菌的66.2%；革兰阳性菌主要是肠球菌属(占总数的24.8%)，以粪肠球菌和屎肠球菌为主，占阳性菌的64.3%；真菌感染以白色念株菌和热带念珠菌多见。胆汁培养阳性率和细菌构成与以往研究大致趋势相同，但也稍有差异[14-16]；这些差异也体现出胆道感染患者胆汁中的病原菌分布及构成受地域、环境等因素的影响较为明显[2]。值得注意的是胆道感染病原菌虽然仍以肠源性细菌为主，如大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、屎肠球菌、粪肠球菌等，但医院感染菌，如铜绿假单胞菌也占一定比例(占总数的8.4%)。铜绿假单胞菌等非发酵菌的检出，可能与广泛开展内镜、T 管引流等侵入性医疗操作从而导致医院内感染有关。厌氧菌检出率较低，可能与本院送检胆汁标本多为需氧培养有关。如果涂片镜检有菌而普通需氧培养阴性，提示厌氧菌感染，应引起重视。另外胆汁培养出两种及以上病原菌例数占总例数的51.3%，提示胆道感染很大比例为混合感染，增加了病情的复杂性和难治性。

大肠埃希菌是胆汁培养中最常见的细菌，其药物敏感性颇受关注。本次研究数据表明超过半数的大肠埃希菌对喹诺酮类抗生素耐药，左氧氟沙星和环丙沙星的耐药率分别为63.2%和64.7%，而张锟等的数据也表明肠杆菌对喹诺酮类药物的耐药率从2011年到2014年呈逐年上升的趋势[17]，这可能和喹诺酮类药物的大量使用有关。另外需要临床引起注意的是此次共检出产超广谱β内酰胺酶的肠杆菌62株，占所有肠杆菌科细菌的41.6%。虽然目前碳青霉烯类耐药菌株(CRE)数量不多(近5年共8株)，但一旦出现，治疗困难，且患者病死率很高，应引起高度重视。非发酵菌占胆汁分离菌的较少(占总数的13.1%)，其中最常见的是铜绿假单胞菌，对常见抗生素普遍敏感，本组中铜绿假单胞菌对头孢类药物、氨基糖苷类药物、喹诺酮类药物和碳青霉烯类药物的耐药率均低于25%。目前未检出广泛耐药的铜绿假单胞菌(MDR-PA)，但临床和感控部门也应高度警惕，防止耐药性强的铜绿假单胞菌的出现及院内感染的流行。

近年来随着抗菌药物种类的不断增加和广泛应用，肠球菌属引起的胆道感染也日益增多[18]。在本研究中，胆道感染患者的胆汁中肠球菌属同样有较高的检出率，达24.8%，与赵水娣等的文献报道相似[19]。其中屎肠球菌最常见，其次是粪肠球菌。既往文献报道肠球菌对头孢类、 喹诺酮类、大环内酯类药物都存在一定的耐药[17]，本研究提示屎肠球菌除万古霉素、利奈唑胺保持较高的敏感性外，对青霉素、氨苄西林、左氧氟沙星等抗菌药物的耐药率明显高于粪肠球菌。万古霉素是目前临床常用的被认为对革兰阳性菌最有效的抗生素之一，既往有研究提示其对胆道革兰阳性菌的耐药率低至0[20]，但近几年文献报道[14]和本次研究提示已有一定程度耐药率，应引起重视。

综上所述，引起胆道感染的致病菌，仍以大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和肠球菌属等肠源性细菌为主,非发酵菌如铜绿假单胞菌等易引起院内感染的病原菌也占一定比例。耐药性强的CRE 和VRE菌的出现增加了临床治疗的难度和复杂性。需要临床医师和检验技师的配合，尽早明确致病菌，结合药敏试验结果选择恰当的抗菌药物，避免出现双重感染或细菌耐药。