甲氨蝶呤血药浓度和基因检测在治疗低危妊娠滋养细胞肿瘤中的价值研究Δ

唐红波，冯 欣，段 微，阴赪宏，康海利，张雪艳，韩朝宏，王鹤尧,，崔 刚，张相林

(1.首都医科大学附属北京妇产医院药事部，北京 100026； 2.首都医科大学附属北京妇产医院妇科肿瘤科，北京100026； 3.中日友好医院药学部，北京 100029)

妊娠滋养细胞肿瘤(gestational trophoblastic neoplasia，GTN)是由妊娠滋养细胞异常发育及增殖所致的与妊娠相关的肿瘤，分为低危妊娠滋养细胞肿瘤(low-risk gestational trophoblastic neoplasia，LRGTN)和高危妊娠滋养细胞肿瘤。LRGTN的一线治疗药物有甲氨蝶呤和放线菌素D[1]。甲氨蝶呤费用相对低，单药化疗方案使用广泛，但是不良反应较常见，部分患者甚至出现严重不良反应和耐药[2]。已有的研究结果显示，影响药物代谢、转运和作用靶标的基因的多态性不仅与甲氨蝶呤的疗效相关，也与其不良反应密切相关，但不同研究间结果的差异较大，目前还无法利用血药浓度和基因多态性精准指导甲氨蝶呤针对LRGTN的个体化治疗[3]。为了进一步提高LRGTN 治疗的有效性、安全性和经济性，减少甲氨蝶呤引起的不良反应和耐药，避免延误病情，本课题组在前期研究[4]基础上，初步探讨甲氨蝶蛉血药浓度监测及代谢、转运相关基因多态性检测作为LRGTN个体化治疗的依据。

1 资料与方法

1.1 资料来源

选择2017年4—7月于首都医科大学附属北京妇产医院就诊的3例LRGTN患者。第1次化疗前进行国际妇产科联合会(international federation of gynecology and obstetrics，FIGO)预后评分。纳入标准：血常规、肝肾功能均正常。患者均首选甲氨蝶呤化疗方案，单次剂量为0.4 mg/(kg·d)，每日同一时间肌内注射，连续给药5 d为1个疗程。化疗期间监测血常规、肝肾功能、人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)水平和药品不良反应。不良反应分级参照世界卫生组织《抗癌药物常见毒副反应分级标准》，分为轻度、中度和重度[5]。

1.2 甲氨蝶呤血药浓度测定

应用EDTA-抗凝管采集患者静脉血2 ml，以3 000 r/min离心15 min后取血浆，应用免疫荧光法测定甲氨蝶呤浓度。

1.3 染色体核型分析

应用EDTA-抗凝管采集患者静脉血2 ml，分离纯化获得白细胞混悬液。应用多重数字荧光分子杂交及杂交测序；当寡核苷酸与染色体杂交时，其所携带的荧光基团会对染色体进行标记；利用荧光检测设备，即可直接检测杂交染色的结果，从而完成目标序列的检测。应用测序反应通用试剂盒，在荧光检测仪上完成自动化分析。检测的基因包括：亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)C677T和A1298C以及编码P糖蛋白的ATP结合盒B亚家族成员1转运蛋白基因(ATP binding cassette subfamily B member 1 transporter，ABCB1)/多药耐药基因1(multi-drug resistance 1，MDR1)T3435C。

2 结果

2.1 患者基本情况

3例患者均首先应用甲氨蝶呤进行化疗，1例患者出现中度发热和皮疹，1例患者出现发热、Ⅲ度骨髓抑制(粒细胞群绝对值最低值为0.88)和耐药(甲氨蝶呤化疗2个疗程后血HCG水平由49.2 IU/L升至93.5 IU/L)，1例患者出现发热、Ⅱ度骨髓抑制(血红蛋白为94 g/L，粒细胞群绝对值最低值为1.14)、肝功能指标升高[丙氨酸转氨酶(ALT)为43 IU/L，天冬氨酸转氨酶(AST)为74 IU/L)]和耐药(甲氨蝶呤化疗3个疗程，血HCG水平降低不明显)。上述3例患者均更换化疗方案继续治疗，至血HCG水平降至正常，患者未出现复发和明显的不良反应。患者各项指标情况见表1。

2.2 甲氨蝶呤的血药浓度

3例患者第1个疗程末次给药后24 h的甲氨蝶呤血药浓度分别为0.012、0.021和0.012 μmol/L；第3例患者于第1

表1 患者各项指标情况Tab 1 Various indicators of patients

次化疗的1、3、5次给药后2和24 h取血测甲氨蝶呤浓度，血药浓度分别为0.953、0.016、1.132、0.012、0.934和0.012 μmol/L。

2.3 甲氨蝶呤相关基因多态性

本研究测定了甲氨蝶呤代谢相关的基因多态性MTHFR C677T、MTHFR A1298C以及与甲氨蝶呤转运相关的基因ABCB1 T3435C，结果见表1。MTHFR C677T基因型方面，不良反应较轻的1例患者为CC型；不良反应严重的2例患者为CT型，其ABCB1 T3435C基因型也均为杂合突变型。3例患者的MTHFR A1298C基因型均为野生型。

3 讨论

3.1 甲氨蝶呤治疗LRGTN的作用机制

甲氨蝶呤是一种叶酸拮抗剂，可干扰滋养细胞分裂。除叶酸受体(folate receptor，FR)外，该药还主要通过还原型叶酸载体(reduced folate carrier，RFC)进入细胞，与细胞内的二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)结合(亲和力远远高于细胞内原有的二氢叶酸)，阻断二氢叶酸转化为具有生理活性的四氢叶酸(四氢叶酸为体内合成嘌呤核苷酸和嘧啶脱氧核苷酸的重要辅酶)，从而使嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸合成过程中一碳单位的转移作用受阻，导致DNA的生物合成明显受到抑制，其对胸腺核苷酸合成酶亦有抑制作用[6]。患有滋养细胞肿瘤时，滋养细胞处于增殖活跃状态，甲氨蝶呤对其的抑制作用更敏感，因此，临床常用低剂量[0.4 mg/(kg·d)]甲氨蝶呤治疗，即可达到很好的治疗效果。参与甲氨蝶呤转运进入细胞的主要包括FR和RFC，甲氨蝶呤在细胞内转运和代谢的关键酶主要包括叶酰多聚谷氨酸合成酶(folyl polyglutamate synthetase，FPGS)、γ-谷氨酸水解酶(γ-glutamyl hydrolase，GGH)、DHFR和MTHFR,将甲氨蝶呤排出细胞的转运体包括溶质蛋白转运体家族编码的有机阴离子转运多肽1B1(organic anion transporting polypeptide B1，OATPB1)、多药耐药蛋白和乳腺癌耐药蛋白等[7-8]。虽然上述酶或转运体的基因多态性、蛋白表达水平对甲氨蝶呤治疗LRGTN时血药浓度的影响研究可能因为各种因素而没有统一确切的结论，但必须肯定的是，甲氨蝶呤药物基因组学研究对于实施“个体化”给药具有重大意义[7]。

甲氨蝶呤进入细胞后在FPGS的催化下转化为更具活性、能停留在细胞内更长时间且更具毒性的活性产物多聚谷氨酸化甲氨蝶呤(methotrexate polyglutamate，MTXPG)；同时，GGH可作用于MTXPG，将其还原为甲氨蝶呤，维持MTXPG在体内的动态平衡，甲氨蝶呤再经蛋白泵泵出细胞外。甲氨蝶呤及其活性代谢物MTXPG都可与DHFR相结合，也可作用于胸苷酸合成酶，抑制其作用，导致DNA合成受阻[9]。甲氨蝶呤导致滋养细胞分化受阻的同时，正常细胞也受到损害而发生不良反应。亚叶酸、左亚叶酸可以给正常细胞直接补充活性叶酸，部分缓解甲氨蝶呤的不良反应，但是不会影响甲氨蝶呤对滋养细胞的毒性。具体机制目前尚未研究清楚，可能是由于正常细胞转运活性叶酸的RFC-1正常，亚叶酸进入细胞多，正常细胞内FPGS活性低，GGH活性高，MTXPG蓄积少，亚叶酸与之结合解毒相对容易；而滋养细胞的细胞膜RFC-1受损，亚叶酸进入细胞少，细胞内MTXPG蓄积多，亚叶酸解毒难度大。

3.2 基因多态性与甲氨蝶呤血药浓度、不良反应的相关性

本研究中，3例患者的甲氨蝶呤谷浓度均<0.1 μmol/L，肌内注射后2 h的血药浓度在0.934～1.132 μmol/L范围内，连续给药5次后2 h的血药浓度较第1次给药后2 h的血药浓度没有明显提高，反复给药甲氨蝶呤在血液中未见明显蓄积，检测出的血药浓度均低于中毒血药浓度(5 μmol/L)，与文献报道结果基本一致[10]。甲氨蝶呤血药浓度虽然很低，但是不良反应并不少见，有些甚至还比较严重，推测其原因可能与药物转运体及代谢基因多态性有关[2，11]。这一相关性在甲氨蝶呤大剂量(400 mg/m2，1日1次，给药1周)静脉滴注治疗侵蚀性葡萄胎的疗效观察中得到证实[12]。宋再伟等[5]系统评价了骨肉瘤患者MTHFR、RFC-1和MDR1基因多态性对大剂量甲氨蝶呤不良反应的影响，结果表明，MTHFR C677T突变可能导致大剂量甲氨蝶呤不良反应发生风险增加，MTHFR A1298C多态性与大剂量甲氨蝶呤不良反应无显著相关性，与本研究结果一致。而RFC1 G81A或MDR1 C3435T多态性与甲氨蝶呤不良反应的相关性尚不明确。

目前没有权威部门提供小剂量甲氨蝶呤血药浓度的界定值。有研究建议，甲氨蝶呤浓度<0.05 μmol/L时可以不测定[10]。也有学者认为，甲氨蝶呤不良反应与其血药浓度相关，需要监测血药浓度并用亚叶酸钙解救，但是证据并不充足，尚需要更多的研究提供依据。相同剂量的甲氨蝶呤对不同类型肿瘤细胞的杀伤作用可能并非完全一致，小剂量甲氨蝶呤就可以杀死处于增殖活跃状态的滋养细胞，可能与妊娠滋养细胞合体化导致其敏感性增加有关[13]；虽然剂量小，但是不良反应仍较多，部分不良反应还很严重，除了与药物转运和代谢等基因突变有关外，是否还有其他机制，也尚待研究探讨。

本研究中，不良反应较轻患者的MTHFR C677T基因型为野生型，而不良反应较重的2例患者的MTHFR C677T和ABCB1 T3435C基因型均为杂合突变型，MTHFR A1298C基因型为野生型。由此可见，MTHFR A1298C与甲氨蝶呤不良反应不相关，而MTHFR C677T和ABCB1 T3435C杂合突变或者纯合突变时，会发生骨髓抑制、肝功能指标升高等严重的不良反应。

3.3 基因多态性与甲氨蝶呤耐药的相关性

甲氨蝶呤耐药仍是GTN治疗的研究热点问题[1]。因此，有必要对GTN的耐药和复发进行讨论和研究。我国2018年《妊娠滋养细胞疾病诊断与治疗指南(第四版)》中明确提出了耐药标准，即经规范化疗2～3个周期后，血HCG水平不降低(或降低幅度<50%)、病灶不缩小，或在治疗过程中出现新的病灶、血HCG水平升高。约有25%的GTN患者在初始化疗后发生耐药，3%的患者会复发，上述患者需要进一步的挽救化疗或联合治疗，最后会有0.5%～5%的患者因为多重耐药而死亡[14-15]。最大肿瘤病灶5 cm、转移病灶5个、血清β-HCG水平>105IU/ L、FIGO/世界卫生组织预后评分5～6分可能是化疗耐药的高危因素[16-18]。陈梦捷等[14]对高预后评分的GTN患者化疗效果及耐药因素进行了分析，结果显示，年龄>40岁、终止妊娠与初次治疗的间隔时间较长是导致预后评分5～6分的LRGTN患者对联合化疗耐药的高危因素。耐药是一个多系统共同参与的复杂过程，涉及多基因和多条信号通路的改变。目前的研究方向主要包括细胞内药物的外排机制、细胞内药物重新分布改变、细胞凋亡抑制和内质网应激介导的细胞自噬等[19]。甲氨蝶呤耐药机制并未研究清楚，主要观点包括：(1)RFC介导的甲氨蝶呤摄取障碍，而不是P糖蛋白介导的外排，因为P糖蛋白优先转运亲水性有机化合物，而并非如甲氨蝶呤这种二价阴离子化合物；(2)ABCB1/MDR1基因多态性，包括C3435T、G2677T/A、C1236T、T266C、G571A、T1985G和G3751A等位点；(3)MDR编码蛋白质P糖蛋白表达和功能改变[20]。耐药产生的根本原因在于滋养细胞经甲氨蝶呤长期诱导后出现耐药表型，导致影响甲氨蝶呤转运和代谢的多个基因表达的改变，可溶性CD105(内皮联蛋白)也可通过调控骨形态蛋白9/Smads通路参与到绒毛膜癌耐药过程[21-22]。本研究中，发生甲氨蝶呤耐药的2例患者未显示出明显的上述临床特征，未出现耐药的患者的MTHFR C677T和MTHFR A1298C基因型均为野生型，而出现耐药的2例患者的MTHFR C677T和ABCB1 T3435C基因型均为杂合突变型，MTHFR A1298C基因型为野生型。本研究结果初步显示，甲氨蝶呤治疗LRGTN出现耐药与MTHFR C677T和ABCB1 T3435C突变有关，其他机制尚待进一步研究。

综上所述，甲氨蝶呤不良反应的严重程度、耐药与MTHFR C677T和ABCB1 T3435C的基因型有关，与MTHFR A1298C的基因型无关；甲氨蝶呤血药浓度与基因多态性之间未见明显的相关性，甲氨蝶呤血药浓度均处于低水平，患者血药浓度之间没有差异，不良反应的严重程度、耐药与血药浓度未见相关性。但是，本研究只是基于3例患者甲氨蝶呤血药浓度和基因检测结果进行的初步探讨，有待更多的研究进一步验证。总之，初步研究结果显示，代谢酶MTHFR和转运体ABCB1的基因突变会导致甲氨蝶呤严重不良反应和耐药的发生，在用药前，建议检测甲氨蝶呤转运和代谢基因分型，根据患者基因分型判断是否可以首选甲氨蝶呤作为化疗药，制定个体化治疗方案，以期提高疗效、减少严重不良反应和耐药的发生，进一步缩短治疗时间和节约医疗成本。