基于整合药理学平台V2.0探讨痰瘀同治方抗心肌缺血再灌注损伤的分子机制Δ

高宏杰，刘思鸿，贡磊磊#，张华敏

(1.中国中医科学院中医药信息研究所党委办公室，北京 100700； 2.首都医科大学附属北京妇产医院药事部，北京 100026； 3.中国中医科学院中药研究所，北京 100700)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是世界范围内导致死亡的主要疾病之一，具有发病率高、预后差和死亡率高等特点。及时恢复血流灌注可挽救更多心肌，是AMI患者最有效的治疗方法。但再灌注本身会引起心脏的结构和功能损伤，如心肌细胞损伤、心肌顿抑、心脏功能降低和恶性心律失常。这一现象称为心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)，即当心肌组织和细胞低灌注缺血一段时间而再次获得血液供应时，缺血损伤没有减轻或者恢复，反而加重的现象[1]。MIRI的临床表现主要有无复流、心肌顿抑、再灌注心肌坏死和再灌注心律失常。随着对MIRI的认识，学者们提出了多种MIRI相关的机制，包括氧自由基学说、钙离子超载、炎症反应、酸碱失衡及线粒体功能障碍等[2-3]。针对MIRI的治疗策略主要有非药物疗法和药物治疗策略，非药物疗法有缺血预适应和缺血后预适应；药物治疗策略有再灌注损伤挽救激酶(reperfusion injury salvage kinases，KISA)途径抑制剂，恢复细胞内低pH的药物和减轻活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)生成、钙离子超载的药物,抗炎化合物，自由基清除剂或抑制剂等[3]。

中医理论及临床研究结果表明，痰瘀是MIRI发生发展过程中的重要病因病机，MIRI病位在心，与肺、肝、脾关系密切，肝主疏泄，疏泄不利，则气血津液流通障碍，生痰饮瘀血；肺主宣降，脾主健运，若肺气不能宣布津液，脾虚不能健运水谷，致使痰浊内生，痰浊滞于血脉，阻碍营血流布同行[4]。痰瘀相关学说是中医理论的重要组成部分，以此为基础提出的痰瘀同治方广泛应用于抗MIRI临床和基础研究中[5-6]。痰瘀同治方由赤芍、瓜蒌等药物组成。唐丹丽等[7]观察了痰瘀同治方对高血症MIRI大鼠血脂、血液流变及炎症的影响，结果表明，痰瘀同治方可通过降低血脂、改善血液流变及降低炎症因子含量，发挥抗MIRI的作用；其作用机制可能与通过调节核因子κB(NF-κB)信号通路减轻炎症反应有关；并且在缺血期间痰瘀同治方能够诱导自噬的表达，再灌注期间可以抑制其过度反应，并在各阶段协同抗凋亡途径发挥心肌保护作用[8]。但痰瘀同治方抗MIRI的深入的分子机制及其质量标志物尚未阐明，本研究通过整合药理学平台V2.0(TCMIP V2.0)，对痰瘀同治方抗MIRI可能的分子机制进行深入挖掘并探索可能的质量标志物。

1 资料与方法

1.1 痰瘀同治方化学成分来源及药物靶标

本研究采用基于中医药百科全书数据库(the encyclopedia of traditional Chinese medicine，ETCM)[9](http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/)的中医药TCMIP V2.0(http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/Login/login.html)[10]“中药材数据库”搜集痰瘀同治方中11味中药的化学成分信息，构建痰瘀同治方化学成分数据库，并根据相应的化学成分信息，利用平台中“中药靶标数据库”，收集痰瘀同治方中中药材对应的靶标。并对药物潜在靶标进行基因本体(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析。

1.2 MIRI靶标收集

对于MIRI疾病靶标，本研究利用TCMIP V2.0平台中“疾病相关分子库”，输入“Myocardial ischemia and reperfusion injury”“Ischemia reperfusion injuries”“Myocardial Reperfusion Injury”和“Myocardial ischemia-reperfusion injury”，收集MIRI疾病靶标，对搜集靶标去重，建立MIRI靶标数据库。

1.3 痰瘀同治方抗MIRI核心靶标网络、GO及KEGG富集分析

利用TCMIP V2.0平台中“中医药关联网络挖掘”模块，构建痰瘀同治方中每味中药成分靶标及目标疾病MIRI潜在靶标之间的相互作用关系，构建“中药-疾病”关联网络，通过计算网络节点的连接度(degree)、介度(betweenness)和紧密度(closeness)，筛选网络中前100位靶标构建核心靶标网络并实现核心网络可视化。继而，对核心靶标进行GO和KEGG富集分析。最后，借助该模快构建“中药-成分-靶标-通路”多维网络，对网络进行可视化分析，挖掘痰瘀同治方中抗MIRI可能的成分，对痰瘀同治方抗MIRI标志物进行初筛。

1.4 痰瘀同治方抗MIRI分子机制及其质量标志物分析

通过对多维网络中药成分参与的生物学过程及其可能通路进行分析，并结合相关文献探讨痰瘀同治方抗MIRI可能的分子机制。此外，质量标志物由刘昌孝院士首先提出，从质量传递与溯源、成分特有性、成分有效性、成分可测性以及复方配伍环境5个方面确定药材质量标志物[11]。本研究以上述5个方面为筛选标准，并结合成分参与的主要生物学过程为重要依据，对痰瘀同治方抗MIRI可能的质量标志物进行分析。

2 结果

2.1 痰瘀同治方药物化学成分及靶标MIRI靶标分析

基于TCMIP V2.0收集痰瘀同治方中赤芍、瓜蒌等药物化学成分共157个，通过平台预测药物靶标共272个。在TCMIP V2.0中搜集MIRI相关疾病靶标信息，通过查找并去重后，共获得疾病靶标290个。

2.2 痰瘀同治方抗MIRI核心靶标网络分析

基于TCMIP V2.0“中医药关联网络挖掘”模块，筛选前100位的靶标进行分析，构建核心靶标网络，在核心网络中含疾病靶标57个，药物靶标73个，药物与疾病共有靶标共31个。对这31个共有靶标进行生物信息学分析。GO富集分析结果显示，这些共有靶标主要富集于血管生成的正调控(positive regulation of angiogenesis)、血管形成(angiogenesis)、自噬正调控(positive regulation of macroautophagy)、脂多糖介导的信号通路(lipopolysaccharide-mediated signaling pathway)、炎症反应(inflammatory response)、凋亡负调控(negative regulation of apoptotic process)、细胞铁离子稳态(cellular iron ion homeostasis)及内皮细胞增殖的正调控(positive regulation of endothelial cell proliferation)等过程，见图1(A)；KEGG富集分析结果显示，这些共有靶标主要富集于FoxO信号通路(FoxO signaling pathway)、缺氧诱导因子(HIF-1)信号通路(HIF-1 signaling pathway)、胰岛素抵抗(Insulin resistance)、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路(TNF signaling pathway)、炎症性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)及血管内皮生长因子(VEGF)信号通路(VEGF signaling pathway)等信号通路，见图1(B)。

图1 痰瘀同治方抗MIRI共有靶标的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析Fig 1 GO function and KEGG pathway enrichment analysis of common targets of Tanyu Tongzhi formula in the treatment of myocardial ischemia reperfusion injury

2.3 痰瘀同治方抗MIRI多维网络及药理作用分析

构建痰瘀同治方抗MIRI“成分-靶标-通路-药理作用”多维网络，获得了46个成分，19个共有靶标，这些共有靶标参与了FoxO信号通路(FoxO signaling pathway)、HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)、TNF信号通路(TNF signaling pathway)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、VEGF信号通路(VEGF signaling pathway)，共有靶标参与的通路主要与炎症反应、血管生成、自噬与凋亡和氧化应激等过程有关，见图2。

图2 痰瘀同治方干预MIRI“成分-靶标-通路-药理作用”多维网络分析Fig 2 Multi-dimensional network of “component-target-pathway-pharmacological action” of Tanyu Tongzhi formula in the treatment of myocardial ischemia reperfusion injury

3 讨论

《血证论》指出，“须知痰水之壅，由瘀血使然，但去瘀血则痰水自消”，痰瘀互结是MIRI主要证候之一[12]。痰瘀同治法可以有效抗MIRI，尤以赤芍、瓜蒌等组成的痰瘀同治方是痰瘀同治法应用的具体体现。本研究基于TCMIP V2.0发现痰瘀同治方通过血管生成的正调控、血管形成、自噬正调控、脂多糖介导的信号通路、炎症反应、凋亡负调控等发挥其功能，此外，痰瘀同治方通过影响FoxO信号通路、HIF-1信号通路、TNF信号通路、PI3K-Akt信号通路及VEGF信号通路等信号通路参与抗MIRI的过程。多维网络分析结果显示，山奈酚、槲皮素、异鼠李素、黄芩素、芍药苷和柚皮素等成分通过作用于KDR、NOS3、VEGF、HIF-1 A、白细胞介素(IL)6、IL-10、TNF、CASP3及CCL2等共有靶标参与PI3K-Akt信号通路、VEGF信号通路、HIF-1信号通路、FoxO信号通路和TNF信号通路。这些共有靶标参与的通路主要涉及氧化应激、自噬、凋亡、血管生成和炎症反应等环节。

氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，体内高活性分子如ROS或活性氮自由基产生过多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤。MIRI通过黄嘌呤氧化酶系统，激活的中性粒细胞和线粒体呼吸链异常产生过量的氧自由基[13-15]。大量的ROS介导的氧化应激是心肌细胞死亡、收缩和舒张功能降低的重要始动因素。研究结果表明，SRIRT1的过表达通过调节糖尿病大鼠内皮型一氧化氮合酶(eNOS或NOS3)活性来减少糖尿病加重的MI/R损伤和氧化应激[16]。eNOS是Akt磷酸化后的下游重要底物之一，PI3K/Akt信号通路调控eNOS的表达，从而促进NO的表达，减轻对心肌细胞的损伤，发挥对MIRI的保护作用[17]。痰瘀证与冠心病其他证型相比氧自由基明显有差异[18]，而痰瘀同治方可以通过调节氧化应激改善MIRI。研究结果显示，PI3K/Akt信号通路在MIRI发生进展中发挥保护心肌细胞的作用，在MIRI期间，激活PI3K/Akt信号通路后，TNF-α和IL-1β等促炎因子过度表达受到抑制，PI3K/Akt信号通路通过减轻炎症反应，从而减轻对心肌细胞的损伤[17]。痰瘀互结证在C反应蛋白(CRP)、TNF-α及IL-6等炎症相关因子方面与非痰瘀证的差异有显著性意义[19]，痰瘀同治方通过影响炎症相关生物学过程改善MIRI损伤。FoxO在MIRI过程中形成PI3K/Akt/FoxO的抗心肌细胞凋亡通路，FoxO3a在维持心脏功能和拮抗氧化应激反应中起着重要作用，FoxO3a表达增加会降低ROS，并促进心肌细胞存活[20]。HIF-1α作为抗缺氧的保护因子，可以刺激VEGF的转录，在MIRI期间，通过激活Akt/HIF-1α/VEGF信号通路促进心肌细胞的存活，抑制MIRI损伤[21]。体内实验结果表明，抑制VEGF表达后可调节凝血级联反应[22]。痰瘀证与非痰瘀证相比，组织纤溶酶原激活物(t-PA)含量降低，组织纤溶酶原激活物抑制物(PAI-1)含量升高，凝血酶原时间(PT)缩短[23]；而痰瘀同治方可以通过VEGF信号通路改善凝血过程。在多维网络图中，发现NOS3和VEGF作为重要靶标参与了PI3K/Akt信号通路、VEGF信号通路和HIF-1信号通路，IL-6参与了PI3K/Akt信号通路、VEGF信号通路、HIF-1信号通路和FoxO信号通路，而AKT1参与了全部5条信号通路。AKTI作为PI3K/Akt信号通路的重要靶标，在活化后，通过调控下游靶标mTOR、eNOS、NF-κB及FoxO等蛋白改善MIRI。TNF、CCL2、IL-6及MAPK10等蛋白参与以炎症反应为主的信号通路(TNF信号通路)，在以上共有靶标中AKT1发挥重要调节作用，既是PI3K/Akt信号通路的重要靶标，也能通过调节下游靶标发挥MIRI的保护作用。而黄芩素、山奈酚、柚皮素和槲皮素通过与AKT1作用影响上述5条信号通路。研究结果表明，黄芩素可减轻MIRI引起的肾损伤，其作用机制可能与抑制TNF-α，调节Bcl2、Bax表达及激活AKT有关[24]。山奈酚通过调节MAPK信号通路减轻炎症和凋亡，进而改善MIRI损伤[25]。柚皮素能有效改善心脏功能，同时减轻心肌细胞的凋亡和梗死，还可以抑制MIRI诱导的氧化应激和ER应激[26]。槲皮素能够通过调节SIRT1/PGC1-α信号通路，改善MIRI诱导的心肌细胞凋亡[27]；还可以通过下调HMGB1-TLR4-NF-κB信号通路减轻MIRI损伤[28]。

结合运用TCMIP V2.0发现，黄芩素、山奈酚、柚皮素及槲皮素的体内吸收和成药性较好，并且上述4种成分作为有效成分可测性好，槲皮素和山奈酚作为银杏叶含量测定成分已在《中华人民共和国药典》中记载[29]。上述4种成分通过与核心靶标作用参与MIRI的发生发展过程，可候选为痰瘀同治方抗MIRI的质量标志物。