茄子SmWRKY65 基因克隆及其对青枯病的抗性分析

刘 开，余炳伟，李丹丹，陈 娜，曹必好

（1.华南农业大学园艺学院，广东 广州 510642；2.华南农业大学农学院，广东 广州 510642）

【研究意义】茄子（Solanum melongenaL.）是茄科茄属常见的蔬菜作物，起源于东南亚的热带地区，在我国南北各地广泛栽培，其根、茎、叶皆可入药，果实中富含蛋白质、脂肪、维生素、龙葵碱和多种微量元素，既可用作蔬食，又具有降血压、防治胃癌等功效［1］，营养价值与药用价值极高。青枯病是茄子栽培中常见的细菌性土传病害之一，其致病因子是青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum），主要从根部侵入寄主植物的维管束部位并迅速扩散到地上部组织，对植株可造成毁灭性的破坏［2］。土温20 ℃左右时为茄子青枯病的发病高峰期，微酸性土壤、连作以及气温急剧上升等都会导致青枯病严重发生［3］。我国茄子青枯病发生较为普遍，发病时严重影响茄子的产量和品质，导致茄子大面积减产减收［3］。但茄子抗青枯病的分子机理十分复杂，涉及多种因子调控，迄今仍未研究清楚。因此，深入开展茄子抗青枯病的相关研究显得尤为重要。

【前人研究进展】植物WRKY 转录因子是一种具有多功能调控作用的转录因子，最早是从甘薯〔Dioscorea esculenta（Lour.）Burkill〕的SPF1基因中被鉴定出来的，因参与调控甘薯中的糖信号转导过程而备受关注［4］。之后，陆续从野燕麦（Avena fatuaL.）、欧芹〔Petroselinum crispum（Mill.）Hill〕和水稻（Oryza sativaL.）的基因中成功鉴定出相应的WRKY基因，并详细阐明了其在植物生长发育、信号转导及其抗逆过程中发挥的重要作用［5-7］。近年来，关于WRKY 转录因子响应生物胁迫及非生物胁迫相关过程的研究多有报道［8］。研究发现，小麦TaWRKY2和陆地棉GhWRKY33基因是响应干旱调节的关键基因，过表达TaWRKY2和GhWRKY33基因能够分别增强小麦和转基因拟南芥植株的抗旱性［9-10］；决登伟等［11］发现，玉米ZmWRKY25-like基因在响应盐胁迫和低温胁迫中上调表达；Sun 等［12］认为，山葡萄VaWRKY33基因在低温胁迫下诱导表达以增强植株的耐寒性。进一步研究发现，WRKY 转录因子在调控植物抗病性方面起关键作用。周茜茜等［13］研究发现，苹果MdWRKY40基因通过介导水杨酸（Salicylic acid，SA）信号途径正向调控苹果对轮纹病菌的抗性；龙琴等［14］认为，过表达CsWRKY61能够激活与生物胁迫和信号转导相关的途径，增强柑橘对溃疡病的抗性；殷丽华等［15］研究发现，小豆VaWRKY33基因能够响应豇豆单胞锈菌的诱导上调表达，并明显提高小豆锈病的抗性；在拟南芥抗病性研究中发现，拟南芥AtWRKY61和AtWRKY70基因分别正向调控芜菁皱叶病毒和丁香假单胞菌的抗性［16-17］；王丹等［18］研究发现，VqWRKY53通过促进SA 和芪类物质的合成，可增强中国野生毛葡萄植株的抗病性。

【本研究切入点】目前已有研究在茄属植物欧白英（Solanum dulcamara）的基因组中克隆得到WRKY基因，并对其相应的生物信息学功能进行了分析［19］，但与茄子青枯病抗性相关的研究仍鲜见报道。【拟解决的关键问题】本研究通过克隆与茄子青枯病抗性相关的SmWRKY65基因，对其进行生物信息学、亚细胞定位及时空表达模式分析，并以清水和pTRV2空载为对照，构建pTRV2-SmWRKY65载体，探究SmWRKY65在茄子抗病植株（E-31）中沉默后对茄子青枯病的响应情况，以期为茄子青枯病抗病机理的相关研究提供理论基础，为茄子青枯病抗性品种的选育提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

茄子抗病材料（S.melongenaL.E-31，R）和感病材料（S.melongenaL.E-32，S）由曹必好教授提供。青枯菌致病菌株从感病材料中分离得到，VIGS 载体构建所需的烟草脆裂病毒载体pTRV-1和pTRV-2由华南地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室保存，DH5α 大肠杆菌转化菌株和GV3101 转农杆菌菌株均购自生工生物科技有限公司。

RNA 提取试剂盒Trizol 购自北京华越洋生物科技有限公司，PCR 反应试剂盒2×HiFiTaq PCR StarMix、快速DNA 胶回收试剂盒StarPrep 和快速质粒小提试剂盒StarPrep 均为GenStar 产品，反转录试剂盒HiScript®ⅡQ Select RT SuperMix for qPCR 和实时荧光定量PCR 试剂盒a SYBR Premix Ex Taq kit 购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 茄子不同组织部位总RNA 的提取与cDNA 的合成 在茄子幼苗三叶期时分别采集茄子根、茎、叶部位的样品，用锡箔纸包裹并迅速放入液氮中，每个样品3 次重复并做好标记，之后采用Trizol 试剂盒的方法分别提取茄子根、茎、叶的RNA，并采用HiScript®ⅡQ Select RT SuperMix for qPCR 试剂盒进行逆转录反应合成cDNA，详细步骤参照说明书。cDNA 合成PCR 反应体系10 μL，反应程序为：25 ℃，10 min；50 ℃，30 min；85 ℃，5 min。

1.2.2SmWRKY65序列的获得与基因克隆 本课题组前期通过转录组测序得到WRKY65基因序列（登录号：Sme2.5_00423.1_g00013.1）。利用Primer 5.0 软件设计引物（SmWRKY65-F、SmWRKY65-R，表1），以茄子叶片cDNA 为模板通过PCR（10 μL 体系）扩增得到SmWRKY65基因序列。PCR 反应程序：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸50 s，32 个循环；72 ℃延伸5 min。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物的特异性，将条带明亮、大小与预期一致的条带采用StarPrep 快速DNA 胶回收试剂盒进行纯化。

1.2.3SmWRKY65的生物信息分析 利用ExPASy ProtParam tool（http://www.expasy.org/tools/protparam.html）对SmWRKY65 蛋白理化性质进行分析；使用ProtScale（http://ca.expasy.org/tools/protscale.html）和SOPM 工具（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=np-sa_sopma.html）分别预测SmWRKY65 蛋白亲/疏水性和二级结构类型；使用NCBI CD Search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Struc-ture/cdd/wrpsb.cgi）和PredictProtein 工具（http://www.predictprotein.org/）对SmWRKY65 蛋白序列进行二级结构的结构域和结合位点预测；通过NCBI Blast 在线比对工具，检索SmWRKY65同源性基因，将相似性较高的同源性序列下载后，利用MEGA 7.0 软件UPGMA 法构建进化树。

1.2.4 PCR 产物的连接与SmWRKY65 质粒的提取 将上述1.2.2 中的PCR 产物连接pMD 19-T载体（pMD 19-T 载体:Solution I :回收产物=0.5 μL :4.5 μL :5 μL），之后转化大肠杆菌感受态DH5α，用pMD19-T 通用引物检测阳性菌落，委托广州擎科生物技术有限公司进行测序，确定重组子。挑取重组子进行扩摇，采用StarPrep 快速质粒小提试剂盒提取SmWRKY65 质粒，具体步骤参照说明书。

1.2.5SmWRKY65的时空表达模式分析 利用Primer 5.0 软件设计SmWRKY65荧光定量引物（q-SmWRKY65-F、q-SmWRKY65-R，表1），以茄子内参18S rRNA（18S rRNA-F、18S rRNA-R，表1）为对照，采用a SYBR Premix Ex Taq Kit 试剂盒对茄子根、茎、叶组织进行SmWRKY65实时荧光定量（qRT-PCR）表达量的测定，详细步骤参照说明书。再分别以茄子抗病和感病植株为材料，在茄子苗3 叶期接种青枯病菌以分析SmWRKY65在茄子抗病和感病植株中的表达情况，并在接种后0、3、6、9 h 4 个时间段分别采集抗病、感病植株叶片，以茄子内参18S rRNA（18S rRNA-F、18S rRNA-R，表1）为对照，采用SmWRKY65荧光定量引物（q-SmWRKY65-F、q-SmWRKY65-R，表1）进行qRT-PCR 表达量的测定，以分析SmWRKY65在抗病和感病材料中的表达量差异。qRT-PCR 程序为：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性10 s、56 ℃退火20 s、72 ℃延伸35 s，35 个循环。每个样品3 次生物学重复，最后取平均值进行分析，基因的相对表达量应用2-ΔΔCt 方法进行分析［20］。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.6 构建亚细胞定位载体及转化洋葱 利用Primer 5.0 软件设计SmWRKY65亚细胞定位引物（SmWRKY65-GFP-EB-F、SmWRKY65-GFPEB-R，表1），通过PCR 反应克隆SmWRKY65亚细胞定位目的片段。使用EcoR I 和BamH I 酶对亚细胞定位载体pC018 和目的片段进行双酶切并连接成重组质粒SmWRKY65-GFP，测序后将重组质粒转入农杆菌GV3101，转化洋葱内表皮组织，3 d 后在显微镜下观察亚细胞定位结果。

1.2.7 VIGS 载体的构建 通过在线工具（vigs.solgenomics.net）寻找特异性的VIGS 载体区域，根据pTRV2载体多克隆位点所包含的酶切位点，设计1 对特异性引物（pTRV2-WRKY65-F、pTRV2-WRKY65-R，表1），以茄子叶片cDNA为模板进行PCR 反应获得长度为250 bp 左右的特异性PCR 产物，用双酶切（EcoR I 和BamH I）法将产物片段连接到pTRV2载体上，之后转入大肠杆菌DH5α，阳性单菌落进行PCR 菌落筛选，送广州擎科生物科技有限公司测序，确定重组子。将阳性单菌落进行扩摇，提取重组质粒（pTRV2-SmWRKY65）后转入农杆菌GV3101 用于侵染。

1.2.8 农杆菌侵染茄子幼苗 将抗病和感病茄子种子分别播种在含泥炭和珍珠岩的混合基质中，于25 ℃、16 h 光照和8 h 黑暗的培养室中进行培养。当茄子幼苗长至3～4 片真叶时，吸取含有重组质粒（pTRV2-SmWRKY65）的阳性菌落扩摇后配制成侵染液，并将分离到的青枯菌采用伤根断根法对茄子幼苗进行侵染，青枯菌的分离与接种参照曹必好等［21］的方法，每组15 株，3 次重复，之后在16 ℃、60 %的相对湿度下暗处理1 d，随后置于培养室中生长。3 d 后采用断根法接种青枯病菌，观察其表型变化并拍照，2 周后调查统计病情指数，方法参照Chen 等［22］，之后通过qRT-PCR 法测定pTRV2-SmWRKY65沉默植株表达量。

试验数据采用SPSS Statistics 17.0 进行t检验，采用Excel 2010 制图。

2 结果与分析

2.1 SmWRKY65 基因的克隆

以茄子叶片cDNA 为模板，通过PCR 扩增得到948 bp 的SmWRKY65片段，经1%琼脂糖凝胶电泳，结果显示目的条带与预期结果一致（图1），将目的条带切胶回收、纯化、测序。对SmWRKY65测序序列与WRKY65原始序列（登录号：Sme2.5_00423.1_g00013.1）在DNAMAN 8.0工具上进行比对，结果显示同源性为88.06%，表明在茄子中成功克隆了SmWRKY65（图2）。

图1 SmWRKY65 电泳结果Fig.1 Electropherogram result of SmWRKY65

2.2 SmWRKY65 蛋白的生物信息学分析

SmWRKY65 蛋白理化性质分析结果显示，该基因开放阅读框为834 个核苷酸序列，编码277 个氨基酸残基，蛋白相对分子量大小为30155.21 ku，等电点为5.51，分子式为C1304H1998N30O430S13，原子总量为4115，预测该蛋白属于亲水性蛋白。对SmWRKY65 蛋白的二级结构进行预测，结果显示，其主要由不规则盘绕结构（72.92%）、α-螺旋（12.27%）、延伸链（11.91%）和β-转角（2.89%）等结构元件组成（图3）。预测该蛋白属于WRKY 家族，在71～131 区域具有1 个含60 个氨基酸的WRKY 保守域，可以特异结合DNA 序列（T）（T）TGAC（C/T），具有DNA 结合位点3 个、蛋白结合位点3 个、核苷酸多肽链结合位点2 个、大分子结合区域7 个，主要多集中在WRKY 家族的保守结构域内，预测该基因定位于细胞核中（图4）。通过NCBI 上Blast 在线比对工具，将检索到的12条与SmWRKY65同源性较高的基因进行多序列比对，使用MEGA 7.0.21 软件构建进化树，结果表明，茄子SmWRKY65与马铃薯、番茄的WRKY65同源性最高（图5）。

2.3 SmWRKY65 的时空表达模式和亚细胞定位分析

以茄子叶片cDNA 为模板，通过PCR 检测SmWRKY65荧光定量引物的特异性，经1%琼脂糖凝胶电泳，结果显示在250 bp 左右有1 条明亮且符合预期的条带（图6A），说明引物特异性较好，可用于后续试验。对茄子根、茎、叶不同组织部位表达量的分析结果显示，SmWRKY65在茄子根组织部位中的表达量最高，在叶中的表达量次之，茎中最低（图6B）。在茄子苗期接种青枯病菌后0、3、6、9 h 4 个时间段分别采集抗病、感病植株叶片进行实时荧光定量分析，结果表明，SmWRKY65在抗病和感病材料中的表达量均随接种时间延长逐渐升高，9 h 时达到最高，且在抗病材料中的表达水平明显高于在感病材料中的表达水平（图6C），说明SmWRKY65响应茄子青枯病抗性相关基因的表达。

使用EcoR I 和BamH I 酶对亚细胞定位载体pC018 和亚细胞定位引物成功克隆出的PCR 片段进行双酶切，并连接成大小为831 bp 的重组质粒SmWRKY65-GFP（图7A），将重组质粒转化农杆菌后转化洋葱表皮细胞，在共聚焦显微镜下观察到SmWRKY65定位在细胞核中表达（图7B），这与预测结果一致。

图6 茄子不同组织及抗感病植株中SmWRKY65 的表达分析Fig.6 SmWRKY65 expression of different tissues and disease-resistant and disease-susceptible plants of eggplant

图7 SmWRKY65 亚细胞定位分析Fig.7 Subcellular localization analysis of SmWRKY65

2.4 SmWRKY6 沉默在抗病茄子中响应青枯病的情况

2.4.1pTRV2-SmWRKY65载体构建结果 以茄子叶片为材料提取RNA 并通过逆转录反应合成cDNA，再以cDNA 为模板，利用构建VIGS 载体所设计的特异性引物进行PCR 扩增，1%琼脂糖凝胶电泳显示，获得长度为242 bp 的PCR 产物（图8A），将产物片段和pTRV2 载体同时用EcoR I和BamH I 进行双酶切后成功将SmWRKY65连接到pTRV2载体上获得重组质粒，经测序保证连接片段和读码方向正确后转入农杆菌GV3101。从阳性菌落检测结果来看，与pTRV2（图8B1）空载相比，pTRV2-SmWRKY65（图8B2）载体构建成功。

图8 pTRV2-SmWRKY65 载体构建Fig.8 pTRV2-SmWRKY65 vector construction

2.4.2 青枯病菌接种VIGS 沉默植株 为了验证pTRV2-WRKY65沉默植株对茄子青枯病的响应情况，在3～4 片真叶时，对茄子抗病植株接种青枯病病原菌。接种7 d 后观察到接种清水的叶片均没有表现出明显的萎蔫症状，接种pTRV2空载的植株仅有1 片叶片出现萎蔫，而接种pTRV2-WRKY65的15 株植株几乎全部表现出萎蔫症状；接种2 周后，对pTRV2-WRKY65植株进行病情指数调查，结果（表2）表明，SmWRKY65基因被沉默后影响了抗病材料对青枯病的抵御能力，即表现为感病症状。pTRV2-SmWRKY65实时荧光定量检测结果（图9）显示，与清水和pTRV2空载相比，pTRV2-SmWRKY65表达量明显下降。

表2 VIGS 沉默植株的病情指数统计Table 2 Statistics of disease index of VIGS silent plants

图9 VIGS 沉默植株的表型（A）及qRT-PCR 分析（B）Fig.9 Phenotype（A）and qRT-PCR analysis（B）of VIGS silent plants

3 讨论

茄子是我国南北各地广泛栽培的夏秋季重要蔬菜之一，在我国的栽培历史悠久，种植面积大，具有较高的营养价值和经济价值。但茄子易受青枯病侵袭，尤其在我国南方地区，其病原菌适应性强、分布广泛、繁殖速度较快，常规方法难以有效防治，而抗病育种可以有效防御病菌的危害，能较大幅度提高茄子的产量和品质［2,23］。近年来，研究人员在提高茄子青枯病抗性及抗病品种选育方面作了较多努力。邵欣欣［24］在茄子青枯病抗性研究中发现，ERF 转录因子参与调控茄子抗青枯病的信号途径；肖熙鸥等［25］研究认为，SA 信号途径中MAPK6、MKK2、NPR1、PAD4等基因能够正向调控茄子青枯病的抗性；李威等［26］研究发现，1.5～2.0 mmol/L 的硅浓度处理可有效提高快圆茄青枯病的抗性；Qiu 等［27］认为，过表达SmMYB44可诱导茄子中亚精胺相关基因（SmSPDS）的表达，促进亚精胺的合成与积累，从而增加对茄子青枯病的抗性。此外，广州市农业科学研究院经过多年研究选育出的翡翠绿2 号青茄新品种在大田抗病性鉴定中表现为中抗青枯病［28］，与广东省农业科学院植物保护研究所联合选育出的紫荣6 号和玫瑰紫花茄均为抗青枯病的优质茄子新品种［29-30］。

研究表明，在生物胁迫下，植物体内会通过信号传导途径和防御反应作出应激防卫，而转录因子在这一系列反应中起关键作用［31］。近年来有关WRKY 转录因子在植株抗病性上的研究成为一个热门话题［32］。已有研究报道，WRKY 转录因子涉及调控与青枯病抗性相关的信号转导过程。王鹏飞等［33］研究发现，野生花生AdWRKY37基因在受到青枯病菌液胁迫诱导后表达量明显升高，并推测该基因可能通过介导水杨酸（Salicylic acid，SA）和茉莉酸（Jasmonic acid，JA）途径参与青枯病抗病相关过程的调控；Dang 等［34］认为，CaWRKY27 转录因子通过调节SA、JA 和内皮素（Endothelin，ET）介导的信号通路，可增强烟草对青枯菌的抗性；Liu 等［35］发现，在烟草中过表达NtWRKY50能够促进SA 合成，从而增强植株对青枯病的抗性；Dang 等［36］在辣椒抗病育种的研究中发现，CaWRKY41 转录因子能够提高辣椒对青枯菌的抗性。然而，有关WRKY 转录因子在茄子青枯病抗性中的相关研究还鲜见报道。本研究以茄子叶片cDNA 为模板成功克隆了SmWRKY65基因，与茄子数据库中原始WRKY65序列比对同源性为88.06%，序列差异性的产生可能与PCR 扩增过程中单核苷酸碱基变异及引物二聚体的形成有关。实时荧光定量分析结果表明，SmWRKY65在茄子抗病和感病植株中均响应青枯病的诱导，其表达量在接种青枯病菌后0、3、6、9 h 4 个时间点不断升高，且SmWRKY65在茄子抗病材料中的表达水平明显高于感病材料，说明SmWRKY65可能涉及茄子青枯病抗病的调节过程。在抗病茄子（E-31）植株中接种青枯菌的分析结果显示，与清水和pTRV2空载相比，SmWRKY65沉默植株表现出明显的萎蔫、易感症状，且qT-PCR 分析表明SmWRKY65在茄子中的表达量较清水和pTRV2空载明显降低，这表明SmWRKY65沉默后可能抑制了茄子青枯病抗病信号途径中相关基因的表达，从而降低了茄子植株对青枯病原菌的抗性。

4 结论

本研究成功克隆了SmWRKY65基因，与茄子数据库中原始WRKY65序列的同源性为88.06%，该基因开放阅读框为834 个核苷酸序列，编码277 个氨基酸残基，在71～131 区域包含1 个含60 个氨基酸的WRKY 保守域，定位于细胞核中，与马铃薯、番茄WRKY65的同源性最高。时空表达分析发现，SmWRKY65在茄子根组织中的表达量最高，叶中次之，茎中最低。实时荧光定量PCR 分析发现，SmWRKY65在茄子抗病和感病材料中均响应青枯病菌的诱导上调表达，且在抗病材料中的表达水平明显高于感病材料；VIGS 结果表明，接种pTRV2-SmWRKY65植株的叶片表现出明显的萎蔫症状，结合qRT-PCR 分析发现，pTRV2-SmWRKY65表达量较对照明显下降，表明SmWRKY65沉默后茄子抗青枯病的能力下降，说明SmWRKY65可能涉及茄子青枯病抗病相关过程的调控。