上调ARHGAP10对前列腺癌细胞和AKT/β-catenin通路的影响

孙春山 李金辉 刘 磊

郑州人民医院泌尿外科，河南省郑州市 450000

2019年数据显示，前列腺癌发病率占男性恶性肿瘤的19%，已成为全世界范围内威胁男性健康的重大问题之一[1]。尽管前列腺癌已在激素治疗、免疫治疗和化疗等方面取得了巨大进步，但总体预后并不理想[2]。RhoGTP酶激活蛋白10(RhoGTPase activating protein 10,ARHGAP10)是RhoGTP酶激活蛋白家族(RhoGAPs)成员，可通过影响RhoGTP酶活性在细胞骨架重组和极性生长等过程中发挥重要作用[3]。既往研究指出，ARHGAP10是一个与肿瘤发生发展密切相关的调控因子，在肺癌、胃癌和卵巢癌等肿瘤中发挥着抑癌作用[4-6]，在前列腺癌组织中表达下调，且与患者预后不良密切相关[7]；然其在前列腺癌发生发展中的机制尚不清楚。本研究拟分析ARHGAP10异位表达对前列腺癌细胞功能的影响，并初步探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养及转染 采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基在5%CO2、饱和湿度和37℃恒温培养箱内培养人前列腺癌PC-3细胞(中国典型培养物保藏中心)。将细胞分为对照(CN)组、阴性对照(NC)组和ARHGAP10组，每组设6个复孔；将对数生长期的PC-3细胞种植6孔板后，参照转染试剂LipofectamineTM3000(美国Invitrogen)说明书将pcDNA3.1空载体质粒和pcDNA3.1-ARHGAP10过表达载体质粒(上海雅吉生物科技有限公司)分别转染至NC组和ARHGAP10组中。

1.2 实时荧光定量PCR 采用Trizol法抽提细胞总RNA后，参照逆转录试剂盒(美国Promega)说明书将RNA合成cDNA；以cDNA 作为模板，参照荧光定量PCR试剂盒(中国Biomiga)说明书进行PCR扩增；以GAPDH为内参照，采用2-△△Ct法计算PC-3细胞中ARHGAP10的表达水平。其中，PCR引物(由上海生工生物合成)如下：ARHGAP10正向引物为5’-CTGCTCCGTTTGGTTCCAGTTG-3’，反向引物为5’-GGAGTCAGTATGCCTCTTGGTAC-3’。

1.3 Western blotting 参照总蛋白提取试剂盒(北京索莱宝)说明书抽提PC-3细胞总蛋白后，二喹啉甲酸法检测蛋白的浓度与纯度；取50μg蛋白样品上样至SDS-PAGE行电泳分离后，转至PVDF膜上；以脱脂奶粉封闭后，加入ARHGAP10(1∶800)抗体(武汉三鹰生物)和Ki67(1∶500)、MMP-2(1∶1 000)、E-cadherin(1∶800)、Vimentin(1∶500)、Bcl-2(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、AKT(1∶1 000)、p-AKT(1∶1 000)、β-catenin(1∶1 000)抗体(美国Santa Cruz)4℃孵育过夜；次日，以辣根过氧化酶标记的二抗(1∶2 000，北京中杉金桥)室温孵育2h。发光剂显影曝光后，以GAPDH为内参照，采用凝聚成像分析系统(北京六一)扫描分析PC-3细胞中ARHGAP10、Ki67、MMP-2、E-cadherin、Vimentin、Bcl-2、Bax、AKT、p-AKT和β-catenin 蛋白的表达水平。

1.4 MTT检测 收集对数生长期的CN组、NC组和ARHGAP10组PC-3细胞，以每孔105个接种至96孔板上，分别在培养24、48、72和96h时，每孔加入20μl 0.5%MTT溶液(北京索莱宝)孵育4h；再加入150μl二甲基亚砜震荡反应10min；采用酶标仪(美国BIO-RAD)在450nm处检测PC-3细胞的OD值。

1.5 Transwell检测 (1)侵袭实验：将Matrigel按照1∶8比例稀释后，取50μl对Transwell小室底部上室面进行包被；收集转染48h后各组PC-3细胞，以无血清培养基调整细胞浓度为106个/ml；在24孔板内加入含血清培养基500μl，放入Transwell小室后，在小室上室中加入细胞悬液100μl。置于培养箱内常规培养过夜后，将Transwell小室取出；以棉签擦去上层残留的细胞，多聚甲醛固定30min，结晶紫染色20min；以磷酸缓冲液冲洗晾干，采用倒置显微镜于200倍下随机选取3个视野拍照并统计细胞数。(2)迁移实验：除了无须以Matrigel包被Transwell小室底部上室面外，其余步骤与侵袭实验相同。

1.6 流式细胞术检测 收集转染48h后的各组PC-3细胞，磷酸缓冲液冲洗3次后，1 000r/min离心5min收集细胞；加入结合缓冲液400μl重悬细胞后，取细胞悬液200μl(浓度105个/ml)于EP管中，加入5μl Annexin V-FITC和5μl PI，避光孵育15min后，上流式细胞仪(美国BD)检测PC-3细胞凋亡情况。

2 结果

2.1 上调ARHGAP10对前列腺癌PC-3细胞增殖的影响 与CN组比较，NC组PC-3细胞中ARHGAP10 mRNA和蛋白表达水平均无统计学差异(P>0.05)，但ARHGAP10组细胞中ARHGAP10 mRNA和蛋白表达水平较CN组和NC组均明显升高(P<0.05)。与CN组和NC组比较，ARHGAP10组细胞增殖活力和Ki67蛋白的表达水平均明显降低(P<0.05)。见图1。

图1 上调ARHGAP10对前列腺癌PC-3细胞增殖的影响

2.2 上调ARHGAP10对前列腺癌PC-3细胞侵袭迁移的影响 与CN组比较，NC组PC-3细胞侵袭、迁移能力以及MMP-2、E-cadherin、Vimentin蛋白表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)；与NC组比较，ARHGAP10组细胞侵袭、迁移能力和MMP-2、Vimentin蛋白表达水平均明显降低，而E-cadherin蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。见图2。

图2 上调ARHGAP10对前列腺癌PC-3细胞侵袭迁移的影响

2.3 上调ARHGAP10对前列腺癌PC-3细胞凋亡的影响 CN组和NC组PC-3细胞凋亡率和Bcl-2、Bax蛋白表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)，但ARHGAP10组PC-3细胞凋亡率、Bax蛋白表达水平明显高于CN组和NC组，而Bcl-2蛋白表达水平明显低于CN组和NC组(P<0.05)。见图3。

图3 上调ARHGAP10对前列腺癌PC-3细胞凋亡的影响

2.4 上调ARHGAP10对前列腺癌PC-3细胞中AKT/β-catenin通路影响 CN组和NC组PC-3细胞中AKT/β-catenin通路相关基因AKT、p-AKT、β-catenin蛋白表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)，但ARHGAP10组细胞中p-AKT、β-catenin蛋白表达水平较CN组和NC组明显降低(P<0.05)。见图4。

图4 上调ARHGAP10对前列腺癌PC-3细胞中AKT/β-catenin通路影响

3 讨论

ARHGAPs是细胞内重要的分子开关，可识别水解GTP，导致Rho族蛋白功能失活，是Rho家族蛋白的特异性抑制因子；ARHGAPs异常表达与包括前列腺癌在内的多种肿瘤的发生发展密切相关[8-9]。在关于前列腺癌骨转移的研究中发现，miR-940可通过靶向调控ARHGAP1诱导成骨细胞表型[10]；ARHGAP21通过调节Rho-GTPases参与前列腺癌能量代谢的调控[11]。ARHGAP29与前列腺癌转移密切相关，其过表达具有促进癌细胞增殖和侵袭的作用[12]。ARHGAP10是ARHGAPs中的一员，也是一种重要的肿瘤抑制因子。ARHGAP10在胃癌中表达下调，且在细胞凋亡过程中发挥着重要的促进作用[13]。另外，ARHGAP10的异位表达可通过抑制VEGF、MMP9蛋白表达和Wnt通路活化等抑制肺癌细胞增殖、侵袭与迁移[4]。近年来有研究报道，ARHGAP10在前列腺癌组织中表达下调，且其低表达与患者不良预后密切相关[7]；但ARHGAP10在前列腺癌中的作用未见报道。

本研究发现，上调ARHGAP10表达后，PC-3细胞增殖活力明显降低，并且细胞增殖核抗原Ki67蛋白的表达水平也明显减弱，提示ARHGAP10可能发挥抑制前列腺癌细胞增殖的作用。上皮间质转化是肿瘤细胞侵袭转移的重要机制，Vimentin是间质细胞标志物之一，在促进上皮细胞形态改变、增强细胞运动能力过程中起着重要作用，而E-cadherin是上皮细胞标志物之一，具有增强细胞间黏连的作用[14-15]。MMP-2是基质金属蛋白酶基因家族成员，可通过特异性降解基底膜的主要成分Ⅳ、Ⅴ型胶原在肿瘤的侵袭转移中起重要作用。本研究结果发现，上调ARHGAP10后，PC-3细胞侵袭迁移能力明显减弱，同时MMP-2和Vimentin蛋白表达水平降低，而E-cadherin蛋白表达水平升高，提示上调ARHGAP10可通过调控MMP-2、Vimentin和E-cadherin蛋白表达抑制PC-3细胞侵袭迁移。Bcl-2和Bax均为Bcl-2蛋白家族成员，前者具有拮抗细胞凋亡的作用，Bax可促进凋亡[16]。本研究进一步检测发现，上调ARHGAP10可使PC-3细胞凋亡率和Bax蛋白表达水平明显升高，而Bcl-2蛋白表达水平明显降低，提示ARHGAP10具有促进前列腺癌细胞凋亡的作用。因此，ARHGAP10可通过调控细胞增殖、侵袭迁移和凋亡在前列腺癌中发挥抑癌作用。

AKT又名蛋白激酶B，是细胞内重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，位于多种信号通路的交叉点，p-AKT为AKT的活化形式，AKT活化后可通过调控下游一系列的效应分子在细胞增殖、凋亡等过程中发挥着重要作用；β-catenin不仅是一种重要的黏附因子，也是Wnt通路下游的关键分子，可与E-cadherin、TCF/LEF和α-连环链蛋白等相互作用，与细胞间黏附和肿瘤转移密切相关；AKT活化可促进β-catenin入核与转录，在促进肿瘤细胞增殖、侵袭迁移和抑制凋亡等过程中起着重要作用[17-18]。有研究指出，前列腺癌中ARHGAP10表达和β-catenin表达呈负相关[7]；而ARHGAP10过表达可通过阻断AKT信号通路抑制结肠癌细胞的增殖和转移[19]。本研究进一步探讨ARHGAP10在前列腺癌中的抑癌机制发现，上调ARHGAP10后PC-3细胞中AKT/β-catenin通路关键分子AKT、β-catenin mRNA和p-AKT、β-catenin蛋白表达水平均明显降低。结果表明，上调ARHGAP10可抑制PC-3细胞中AKT/ β-catenin通路的活化。提示在前列腺癌中ARHGAP10可能通过调控AKT/β-catenin途径影响肿瘤细胞生物学功能，进而发挥抑癌作用。

综上所述，上调PC-3细胞中ARHGAP10表达可抑制细胞增殖、侵袭迁移并诱导细胞凋亡，其作用机制可能与抑制AKT/β-catenin通路有关。ARHGAP10在前列腺癌中发挥着抑癌基因的作用，其可能是前列腺癌分子治疗的潜在靶点。