高效液相色谱法测定维生素D3粉中的有关物质

李行友 周媚

重庆海默尼制药有限公司 重庆北碚 400700

维生素D3粉进口药品注册标准JX20080096[6]中现只有含量测定方法，目前尚无测定维生素D3粉中有关物质的报道，根据现在的法规要求，为了加强对原料药维生素D3粉的质量控制，需要建立起其有关物质的检测方法，对维生素D3粉进行有关物质的研究。

维生素D3粉是类白色至淡黄色的易流动的颗粒，为维生素D3和生育酚等的混合粉，每克维生素D3粉含维生素D3为2.5mg（即2.5mg /g）（100，000-110，000单位）。该维生素D3加入了大豆油、明胶等辅料制成包合物的形式，提高了稳定性。但包合物的形式对维生素D3的提取、以及其有关物质的提取难度增大，同时由于相关辅料的存在，对有关物质的分离造成干扰。

我司对比了《中国药典》2015年版[1]、EP药典[2]、BP药典[4]、USP药典[6]、JP药典[7]及进口药品注册标准JX20080096[8]等标准，其中纯维生素D3的质量标准中包含有关物质项。但只有BP药典[3]、EP药典[5]（注：EP药典与BP药典维生素D3粉项下内容完全相同）和进口药品注册标准JX20080096[8]中有维生素D3粉的质量标准，其余各国药典均是纯维生素D3，而所有维生素D3粉的质量标准中现都无有关物质检测项目和检测方法。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪（Waters e2695+2489）；分析天平（赛多利斯BSA224S、BT25S）；维生素D3对照品（批号：100061-201809），含量：99.9%，中国食品药品检定研究院）；维生素D3粉（10万单位/克，瑞士DSM Nutritional Products Ltd）；有关物质杂质A（Trans-Vitamin D3，反式维生素D3，批号8-ATH-68-1）、杂质B（（3β）-7-Dehydro Cholesterol，Provitamin D3，前体维生素D3，批号：10-GHZ-137-1）、杂质C（Lumisterol，光甾醇D3，批号：15-UPA-103-1）、杂质D（Iso-tachysterol，异速甾醇D3，批号：13-MGG-168-1）、杂质E（Tachysterol，速甾醇D3，批号：14-YKZ-119-1）均来至于Toronto Research Chemicals Inc（多伦多研究化学品公司）。正己烷、正戊醇、异丙醇和异辛烷为色谱纯；氨水、双氧水等均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

正相色谱柱（A gilent Z O R B A X R X-SIL（5μm，4.6×250mm），以正已烷-正戊醇（99.7：0.3）为流动相，流速为每分钟2.0mL，检测波长为265nm。进样体积：20μL。运行时间：维生素D3主峰保留时间的2倍。

2.2 专属性

2.2.1 已知杂质定位确定

精密称取相应的维生素D3对照品，杂质A（反式维生素D3）对照品、杂质B（前体维生素D3）对照品、杂质C（光甾醇D3）对照品、杂质D（异速甾醇D3）对照品、杂质E（速甾醇D3）对照品、前维生素D3对照品适量，除维生素D3对照品外，其它杂质用少量的三氯甲烷约1ml左右溶解后，再用异辛烷稀释，配制成混合溶液，精密量取该混合溶液20μL注入液相色谱仪。理论板数按维生素D3峰计应不低于1500。前维生素D3峰（与维生素D3相对保留时间约为0.5），反式维生素D3峰（与维生素D3相对保留时间约为0.6），维生素D3峰与速甾醇维生素D3峰（与维生素D3相对保留时间约为1.1）之间的分离度均应大于1.5.

分别对已知杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E的出峰顺序及时间进行确定。确定每个已知杂质的位置如图1，各杂质能完全分离。分离度结果见表1：

表1 维生素D3 有关物质分离度结果数据

图1 维生素D3 有关物质色谱图

2.2.2 空白辅料

按照处方比例取本品空白辅料（生育酚、大豆油、明胶等），维生素D3粉样品4.0g，照“2.3”项测定方法，制得空白辅料溶液和供试品溶液，分别进样20μL，记录色谱图。空白辅料色谱图如图2，空白辅料基本无干扰。维生素D3粉样品色谱图如图3。

图2 空白辅料色谱图

图3 维生素D3 粉有关物质色谱图

2.2.3 破坏性试验

维生素D3粉样品经酸（1mol /L 盐酸溶液，2.5h）、碱（1mol /L 氢氧化钠溶液，2.5h）、光照（4500lx，20d）、氧化（30%双氧水溶液，5h）、高温（90℃，1h）等进行破坏，然后按“2.3”项测定方法配制破坏性溶液，进样分析。结果表明，经高温、光照破坏后，维生素D3粉含量降幅程度大，酸、碱、氧化等破坏含量降幅不大。但所有破坏实验均会使样品有关物质个数增多，杂质总量增加。本研究建立的正相色谱条件能使样品中的主成分、主要有关物质和相邻杂质有效分离，光照破坏维生素D3粉样品色谱图如图4。

图4 光照破坏维生素D3 粉样品色谱图

2.3 测定方法

避光操作，称取维生素D3粉4.0g，置250mL具塞量筒中，加入60mL的0.3%氨水在50℃的水浴中，手动振摇5分钟，取出，加入100mL异丙醇手动振摇2分钟，再加入50mL异辛烷在振荡器中，以振动频率200次/分钟振摇30分钟，再手动振摇2分钟，静止分层后，加水30mL，摇匀，取上清液至圆底烧瓶中；再用异辛烷提取4次（50mL/次），合并所有异辛烷在40℃下旋蒸至干，用异辛烷洗涤，并定量至10mL，摇匀，即得供试品溶液（1.0mg VD3/mL）。

对照品溶液（1.0μg VD3/mL）：取供试品溶液1.0mL用异辛烷稀释至20.0mL。再取1.0mL用异辛烷稀释至50mL。

系统适用性溶液：取维生D3对照品12.5mg，用正已烷溶解，并稀释至100mL，取5ml置具塞玻璃容器中，通氮后密塞，置90℃水浴中加热1小时，取出，迅速冷却，加正已烷5ml，摇匀，置1cm具塞石英吸收池中，在2支8w主波长分别为254nm和365nm的紫外下照射5分钟，使溶液中含有前维生素D3、反式维生素D3、维生素D3、和速甾醇D3.按2.1的色谱条件操作。理论板数按维生素D3峰计算不低于1500，前维生素D3与杂质A（反式维生素D3）之间的不得低于1.5.均符合规定。

2.4 线性关系试验

取维生素D3对照品适量，精密称定，用异辛烷配制成0.05μg/mL、0.10μg/mL、0.30μg/mL、0.50μg/mL、0.75μg/mL、1.0μg/mL（100%测试浓度）、1.25μg/mL、1.5μg/mL的溶液，精密量取20μL分别注入高效液相色谱仪，在2.1的色谱条件下，以进样量为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果线性关系良好。

2.5 精密度试验

分别取维生素D3粉4.0g6份，照“2.3”项测定法，分别制得6份供试品溶液，同时制得6份对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20ul，注入液相色谱仪，记录色谱图。按2.1的色谱条件操作，连续进6针，对照品溶液中维生素D3峰的相对标准偏差为2.6%.结果表明方法精密度较好。

2.6 中间精密度试验

另一操作人员，照“2.5”项重复操作测定。对照品溶液中维生素D3峰的相对标准偏差为2.2%.以上两次精密度测试的12份结果进行统计，对照品溶液中维生素D3峰的相对标准偏差为3.0%.结果表明方法中间精密度良好。

2.7 检测限与定量限

取维生素D3对照品适量，精密称定，用异辛烷溶解，定量稀释制成一系列浓度的溶液，取上述溶液20μL 进样，记录色谱图。结果表明，维生素D3的检测浓度为0.024μg /mL（S /N=3），定量浓度为0.079μg /mL（S/N=10）。

2.8 溶液稳定性

取维生素D3粉样品溶液，每隔一定时间进样20μL进行测试，结果表明样品溶液在24h内稳定。

2.9 回收率试验

取约相当于维生素D3粉4.0g的空白辅料，9份，精密称定，分别至250mL具塞量筒中，分别加入50%、100%、150%的维生素D3对照品各3份，照“2.3”项测定法，制得供试品溶液，精密取20μL进样检测，按2.1的色谱条件操作，按外标法计算，计算维生素D3的回收率。50%（n=3）、100%（n=3）、150%（n=3）水平的平均回收率分别为96.95%、92.22%、96.10%，RSD%（n=9）为2.6%，结果表明上述HPLC法测定维生素D3粉中维生素D3有关物质准确度高。

2.1 0 耐用性试验

调整流动相比例：将正戊烷：正戊醇（99.7：0.3）调整为（99.5：0.5），采用同一对照品及供试品溶液，以测定维生素D3粉的有关物质A（反式维生素D3）为考察指标，所测得的有关物质A（反式维生素D3）RSD（n=8）为4.4%，说明此色谱系统和提取方法用于维生素D3粉中有关物质测定耐用性较好。

2.1 1 样品测定

使用已建立和验证的方法对DSM公司生产的维生素D3粉原料药有关物质进行了检测，检测结果见表2。

表2 DSM 公司3 批维生素D3 粉有关物质检验结果数据

依据《化学药物杂质研究的技术指导原则》[9]等进行判定，DSM公司生产的维生素D3粉原料药，3批样品中有2批杂质A（反式维生素D3）是低于报告限0.05%（日用量≤2g）的；有1批次高于报告限，但低于各国药典维生素D3品种项下对该特定杂质的最严限度（0.1%）（中国药典限度为0.5%）。证明该产品中杂质A（反式维生素D3）含量符合各国药典的规定。

另外，3批样品检验结果均显示杂质B（前体维生素D3）、杂质C（光甾醇D3）、杂质D（异速甾醇D3）未检出。而3批样品中的杂质E（速甾醇 D3）均低于报告限0.05%（日用量≤2g）的。证明该产品中杂质E（速甾醇D3）含量符合各国药典的规定。

有关物质总量：各国药典维生素D3品种项下的限度是1.0%，3批样品的检测远低于这个标准。

以上表明，所建立的分析方法能准确检验维生素D3粉中各有关物质的含量。

3 结语

由于该维生素D3粉加入了大豆油、明胶等辅料制成了包合物的形式，提取测定时为保证维生素D3及其有关物质提取完全，同时保证对维生素D3及有关物质不产生破坏，除避光和控制温度，本文采用了以0.3%氨水为溶解介质，使用异辛烷萃取，维生素D3稳定，保持完好，回收率高，其它辅料杂质较少，提高了维生素D3有关物质的准确度，操作较简单。同时由于每克维生素D3粉仅含维生素D3为2.5mg，使用的样品量较大（为4.0g左右），采用了提取、旋蒸浓缩过程，保证能使用HPLC-UV上进行检测控制其有关物质，同时利用获得的维生素D3已知有关物质，利用相对保留时间辅以定位，不需要质谱（MS）即可准确检测其维生素D3有关物质。可用于维生素D3粉中有关物质的测定。