IFN-γ对乳腺癌溃疡创面组织中成纤维细胞的影响

李璐 尹燕锋 杨越 杨鑫 高建虎

[摘要]目的：通过体外培养人乳腺癌难愈合创面中成纤维细胞，并应用TGF-β/Smad信号通路阻断剂干扰素γ（IFN-γ）干扰后，探讨IFN-γ在乳腺癌难愈合创面中所发挥的作用和影响。方法：采用酶消化法对人乳腺癌溃疡创面组织行体外成纤维细胞原代培养。将实验细胞分成A、B、C、D共四组，A组为IFN-γ 5 000U/ml组;B组为IFN-γ 10 000U/ml组;C组为对照组，不加药物;D组为空白组。分别于第7天、第14天将培养细胞接种于96孔板内，用MTT法测定细胞增殖情况。结果：第7天及第14天A组吸光值与对照组C组比较差异无统计学意义（P>0.05）;B组吸光值均低于对照组C组，差异具有统计学意义（P<0.05）。结论：IFN-γ对成纤维细胞的增殖抑制受到浓度的影响，浓度10 000U/ml时明显抑制了体外培养成纤维细胞的增殖，而在较低浓度（5 000U/ml）时对体外培养成纤维细胞增殖无明显抑制作用。

[关键词]乳腺癌;成纤维细胞;干扰素γ（IFN-γ）;溃疡创面;难愈合创面

[中图分类号]R737.9    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2021）03-0099-03

Effect of IFN-γ on Fibroblasts in Wound Tissue of Breast Cancer Ulcer

LI Lu1 ，YIN Yan-feng2，YANG Yue1，YANG Xin1，GAO Jian-hu1

（1.Department of Breast Surgery; 2.Biomedical Research Center，Gan Mei Hospital Affiliated to Kunming Medical University，Kunming 650011，Yunnan，China）

Abstract： Objective  The role and influence of IFN-γ in refractory wounds of breast cancer were investigated by in vitro culture of fibroblast cells in refractory wounds of breast cancer and interference with IFN-γ （TGF-β/Smad signaling pathway blocker）. Methods  In vitro fibroblast primary culture was performed on the wound tissue of human breast cancer ulcer by enzyme digestion. The experimental cells were divided into four groups： group A， group B， group C and group D. Group A was IFN-γ 5 000U/ml group， group B was IFN-γ 10 000U/ml group; group C was the control group without drugs， group D was blank group. The cultured cells were inoculated into 96-well plates on the 7th and 14th day respectively， and cell proliferation was determined by MTT method. Results  There was no significant difference in OD value between group A and control group C on the 7th and 14th day（P>0.05）. The OD value of group B was lower than those of group C， the differences were statistically significant（P<0.05）. Conclusion  The inhibition of IFN-γ on proliferation of fibroblasts was affected by the concentration， the concentration at 10 000U/ml significantly inhibited proliferation of fibroblasts cultured in vitro， while the lower concentration of IFN-γ at 5 000U/ml no obvious inhibitory effect on the proliferation of fibroblasts.

Key words： breast cancer; fibroblast; interferon-γ（IFN-γ）; ulcer wound; refractory wound

轉化生长因子-β（Transforming growth factor β，TGF-β）是一种多向性、多效性的细胞因子，以自分泌或旁分泌的方式通过细胞表面的受体信号转导途径调节细胞的增殖、分化、凋亡，对细胞外基质的合成、创伤的修复、免疫功能等有重要的调节作用[1]。TGF-β参与创面愈合的全过程[2]。Smad是指参与TGF-β细胞内信号传导的相关蛋白，统一命名为Smad信号蛋白，是TGF-β受体作用的直接底物，是将配体与受体作用的信号由胞浆传导至细胞核的中介分子[3]。本研究通过对体外培养成纤维细胞使用TGF-β/Smad信号通路阻断剂干扰素-γ（IFN-γ）后，观测体外培养的人乳腺癌难愈性创面成纤维细胞生长及细胞功能方面的变化，为了解TGF-β/Smads信号通路在人乳腺癌难愈性创面愈合过程中发挥的作用及其程度，探讨促进人乳腺癌难愈性创面愈合的新方法。

1  材料和方法

1.1 主要试剂和仪器：CDEM高糖培养基 （sigma）D6429-500ml;胎牛血清;DPBS（gibco）8113346;青霉素-链霉素（gibco）;MTT试剂盒（sigma）CGD1;0.25%胰酶（gibco）1213981;干扰素-γ（IFN-γ）购自上海克隆生物高技术有限公司;二甲基亚砜（DMSO）;96孔培养板;25cm2培养瓶;3cm培养基;CO2孵育箱;显微镜;微型震荡仪;酶标仪等由昆明市第一人民医院分子生物实验中心提供。

1.2 标本来源：临床常见人乳腺癌溃疡创面组织，经过常规换药3个月仍然难愈合的溃疡创面组织且面积大于5cm×5cm，经过病理学活检鉴定创面组织有乳腺癌浸润生长。取该创面组织，采用酶消化法进行成纤维细胞的原代培养。

1.3 实验方法

1.3.1 分组：实验细胞分成A、B、C、D共4组，A组为IFN-γ5 000U/ml组;B组为IFN-γ10 000U/ml组;C组为对照组，只有培养细胞，不加IFN-γ;D组为空白组，与实验孔平行设置不加细胞只加培养液，其他实验条件保持一致，用于比色时仪器调零。

1.3.2 细胞培养：①所得组织切除坏死组织（不小于1cm3），放于15ml离心管中（瓶中放加过双抗的生理盐水）;②用镊子将组织从瓶子中取出，放入75%酒精的3cm培养皿中浸泡5～10s;③用加过双抗的生理盐水冲洗浸泡2遍（每次不少于10s）;④去除暴露在外的组织和脂肪组织，用4℃加双抗的DPBS（gibco）8113346缓冲液冲洗组织2遍，置于0.25%胰酶（gibco1213981）中在4℃条件下孵育18h，用无血清的CDEM高糖培养基（sigma）D6429-500ml浸润后置于干净的3cm培养皿中;⑤将组织剪切成1～2mm3的小块，将剪好的组织小块排列于25cm2的培养瓶中，用marker笔标记好日期等信息;⑥将培养瓶置于37℃、5% CO2条件下孵育1～3h;⑦预热二甲基亚砜（DMSO）完全后，将培养基置于37℃;⑧培养瓶中，每瓶加入5ml预热好的青霉素-链霉素（gibco），其中含青霉素100U/ml、链霉素各100U/ml、胰岛素40U/200ml和10%胎牛血清的CDEM高糖培养基（sigma）D6429-500ml中，置于37℃、5% CO2条件培养箱中培养;⑨以后每隔3d换1次培养液。

观察到成纤维细胞于培养后第3天开始繁殖，由组织块开始向四周扩展，于第3天加入干扰素γ（IFN-γ）（购自上海克隆生物高技术有限公司）。A组加入浓度为5 000U/ml的IFN-γ、B组加入浓度为10 000U/ml IFN-γ后继续培养，隔日每组加入与之前同组别相同浓度的IFN-γ。分别于第7天、第14天分别取培养细胞用MTT法检测细胞增殖情况。

1.3.3 MTT法检测细胞增殖：①将实验细胞接种于96孔板内，浓度为每孔104/200μl，继续培养24h;②弃去细胞培养板中培养液，每孔中加入4mg/ml MTT试剂盒（sigma）CGD1溶液100μl，继续培养4h;③终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入150μl二甲基亚砜（DMSO），在微型振荡器上震荡5min，使结晶充分溶解;④比色：选择490nm波长，用D组空白组仪器调零，在酶标仪（由昆明市第一人民医院分子生物实验中心提供）上测定每孔光吸收值（OD值），并记录结果。

1.4 统计学分析：数据用均数±标准差（x?±s）表示，采用SPSS 24.0 for windows统计软件包进行配对t检验。处理检验水准α为0.05，P<0.05差异有统计学意义。

2  结果

成纤维细胞于培养后第3天开始繁殖，由组织块开始向四周扩展。分别于第7天（见图1）、第14天（见图2）分别取培养细胞，接种于96孔板内，用MTT法做细胞增殖的测定。第7天A组吸光值（OD值）为0.198±0.082与对照组C组0.201±0.008比较，差异无统计学意义（P=0.941>0.05）;B组吸光值（OD值）为0.145±0.013低于对照组C组0.201±0.008，差异有统计学意义（P=0.006<0.05）;第14天A组吸光值（OD值）为0.206±0.054与对照组C组0.189±0.052比较，差异无统计学意义（P=0.692>0.05）;B组吸光（OD值）值0.164±0.057低于对照组C组0.189±0.052，差异有统计学意义（P=0.012<0.05）。实验表明IFN-γ在浓度10 000U/ml对体外成纤维细胞的增殖有抑制作用，而浓度5 000U/ml对体外培养成纤维细胞的增殖无明显抑制作用。

3  讨论

众所周知，TGF-β/Smad信号通路作为一个庞大的超家族，与创面愈合、疾病发生发展、肿瘤的发生发展密切相关[4]。TGF-β可同时作为肿瘤抑制物和肿瘤促进物存在，其作用的发挥在肿瘤早期起抑制作用，而在肿瘤后期起促进作用[5]。而这个作用是通过的TGF-β/Smad中成员的缺失突变，以及抑制型TGF-β调节来影响恶性肿瘤的发生发展[6]。Smad2和Smad4在人恶性肿瘤中的灭活表明他们是抑癌基因调节转录的重要分子，其突变或表达的失活与多种恶性肿瘤的发生发展有关[7]。TGF-β/Smad导致的生长抑制应答的缺失，易导致上皮细胞恶性肿瘤的产生[8]。

目前，已发现的Smad分子共有8种，其中Smad2，3，4，6，7与TGF-β的信号调控最为密切，并将这5种Smad按其功能分为3类：①受体调节型Smad，即Smad2与Smad3。配体与受体结合后，即能磷酸化Smad2，Smad3使其激活;②共用型Smad，即Smad4。Smad2与Smad3激活磷酸化后必须与Smad4形成复合物，才能迁移至胞核中促进靶基因表达;③抑制型Smad，包括Smad6和Smad7[9]。目前，对于Smad7阻断TGF-β信号通路，以及其对器官纤维化的实验研究成为广大学者研究的热点。Smad7可阻断信号通路下调了TGF-β的细胞内信号传导，減少其自身基因表达[10]。同时，Smad7的表达可以受到其他信号转导通路的影响。比如，IFN-γ通过Jak1酪氨酸蛋白激酶和Stat1转录因子可以增强Smad7的表达，而达到抑制TGF-β的作用[11]。

本试验通过体外培养乳腺癌难愈合创面中成纤维细胞并应用外源性IFN-γ增强Smad7的表达而抑制TGF-β/Smad信号通路，探讨IFN-γ的作用及其影响。实验取人乳腺癌溃疡创面组织，进行体外细胞培养其成纤维细胞。采用酶消化法进行成纤维细胞的原代培养。通过本实验结果说明IFN-γ在第7天和第14天均抑制了成纤维细胞的增殖。但是，IFN-γ对成纤维细胞增殖抑制受到浓度的影响，浓度在10 000U/ml明显抑制了体外培养成纤维细胞的增殖。而IFN-γ在较低浓度5 000U/ml对体外培养成纤维细胞的增殖无明显影响。说明，IFN-γ在浓度10 000U/ml对体外成纤维细胞的增殖有抑制作用，而浓度5 000U/ml时对体外培养成纤维细胞的增殖无明显抑制作用。

通过阻断TGF-β/Smads通路的信号转导，观测体外培养的人乳腺癌难愈合创面成纤维细胞生长及细胞功能方面的变化，浓度在10 000U/ml明显抑制了体外培养成纤维细胞的增殖;IFN-γ对于创面愈合的影响是通过抑制成纤维细胞的生长增殖，增生缓慢，从而影响创面愈合。目前对于体外培养成纤维细胞应用外源性IFN-γ来阻断TGF-β/Smad通路未见报道，本研究表明TGF-β/Smads信号通路在乳腺癌难愈合创面中所发挥的作用，为临床促进乳腺癌难愈合创面愈合提供实验数据和理论依据。将在今后实验研究中进一步探讨其药理规律，为临床药物试验提供理论依据，以便患者得到更为积极的药物治疗。

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[收稿日期]2019-10-25

本文引用格式：李璐，尹燕鋒，杨越，等.IFN-γ对乳腺癌溃疡创面组织中成纤维细胞的影响[J].中国美容医学，2021，30（3）：99-101.