葛根素对大鼠乳房脂肪组织增殖的影响及其机制研究

陈宇 温洁仪 韩萍 刘冠廷 张光耀 杜志云

[摘要]目的：通過研究葛根素（Puerarin，Pur）对3T3-L1前脂肪细胞增殖分化及大鼠乳房脂肪组织的影响及其相关蛋白表达的调控，旨在探讨Pur对乳房脂肪组织的影响及其机制。方法：采用体外培养3T3-L1前脂肪细胞测定不同浓度Pur对3T3-L1脂肪细胞分化过程中胞浆脂滴积累的影响，通过Western blot、免疫荧光实验检测Pur对解偶联蛋白（Uncoupling protein 1，UCP-1）、重组人CCAAT增强子结合蛋白（CCAA Tenhancer-binding protein α，C/EBP-α）表达水平;进一步考察大鼠乳房涂抹不同浓度的Pur对脂肪组织增殖的影响，通过HE染色检测乳腺脂肪细胞体积、免疫组化检测乳腺脂肪蛋白，分析其增殖机制。结果：Pur通过上调3T3-L1细胞中脂肪分化相关蛋白UCP-1、C/EBPα的表达，显著促进3T3-L1脂肪细胞分化过程中胞浆脂滴积累。此外，体内实验结果显示Pur能促进大鼠乳房脂肪细胞增多，脂肪细胞直径增大，且促进乳腺UCP-1、C/EBPα的表达。结论：Pur显著促进大鼠乳房脂肪组织增殖，其作用机制可能与上调脂肪分化相关的蛋白 UCP-1、C/EBPα的表达有关。

[关键词]葛根素;大鼠乳房脂肪组织;3T3-L1前脂肪细胞;增殖

[中图分类号]R622    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2021）03-0093-06

Effects of Puerarin on Rat Breast Adipose Tissue Proliferation and its Mechanism

CHEN Yu1，2，WEN Jie-yi3，HAN Ping3，LIU Guan-ting1，ZHANG Guang-yao1，DU Zhi-yun1

[1.School of Biomedicine，Guangdong University of Technology，Guangzhou 510006，Guangdong，China;2.Infinitus （China） Co.， Ltd. R & D Center，Guangzhou 510653，Guangdong，China;3.Foshan Allan Conney Biotechnology Co.， Ltd.，Foshan 523281，Guangdong，China]

Abstract： Objective  To study the effect of puerarin （Pur） on the proliferation and differentiation of 3T3-L1 preadipocytes and rat breast adipose tissue and the regulation of related protein expression， aiming to explore the effect of puerarin on breast adipose tissue And its mechanism. Methods 3T3-L1 preadipocytes were cultured in vitro to determine the effect of different concentrations of puerarin on the accumulation of cytoplasmic lipid droplets during the differentiation of 3T3-L1 adipocytes. The expression level of the uncoupling protein and the recombinant human CCAAT enhancer binding protein （C/EBP-α） was detected by Western blot and immunofluorescence experiments. Further， to investigate the effect of applying different concentrations of puerarin on the proliferation of adipose tissue in rat breasts， The volume of mammary fat cells was detected by HE staining， and the mammary adipose protein was detected by immunohistochemistry， and the proliferation mechanism was analyzed. Results  Pur up-regulated the expression of UCP-1 and C/EBPα in 3T3-L1 cells， which significantly promoted the accumulation of cytoplasmic lipid droplets during the differentiation of 3T3-L1 cells. In addition， in vivo experiments show that Pur can promote the increase of rat breast fat cells， increase the diameter of fat cells， and promote the expression of breast UCP-1 and C/EBPα. Conclusion Pur significantly promotes the proliferation of rat breast adipose tissue， and its mechanism may be related to the up-regulation of the expression of UCP-1 and C/EBPα， which are related to fat differentiation.

Key words： puerarin; rat breast adipose tissue; 3T3-L1 preadipocytes; proliferation

乳房是女性的第二性征，也可展示女性美与自信，但仍有不少女性有乳房发育不良的困扰。目前对改善乳房发育不良的方法，包括药物、激素、手术填充、针灸等[1]，但可能存在诱发内分泌失调等疾病的副作用。近年来，食疗及体外涂抹含有美乳功效的天然成分受到广大女性的欢迎，主要采用葛根、啤酒花、红花等天然植物制备而成。研究表明，葛根可以有效增大胸围，改善胸部毛细血管微循环，产生美乳丰胸的功能。云巾宴等研究发现葛根中活性成分Pur能促进3T3-L1细胞分化成脂，可能具有促进脂肪形成的作用[2-3]，体内实验通过激素水平途径证实Pur能促进小鼠乳房发育[4]。截止目前，关于Pur促进乳房发育的具体分子通路机制尚未清晰，因此，有必要阐明Pur促进脂肪细胞及乳房发育的分子通路机制。前体脂肪细胞的分化促进脂肪的形成并堆积，通过研究脂肪组织中调控前体脂肪细胞转化为脂肪细胞的分子机制，有助于调控脂肪的增殖，具有重要意义。研究表明，3T3-L1前脂肪细胞模型常用作研究脂肪生成的分子机制[5]。因此，本研究通过以Pur为原料，研究其对3T3-L1细胞分化成脂作用，并采用SD大鼠模型，在大鼠乳房外涂Pur，测试其对乳房脂肪增殖的影响，并进一步探讨其作用机制，为葛根类的美乳丰胸产品提供理论依据。

1  材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试剂：Pur由无限极（中国）公司提供，市售美胸乳（Bea）由无限极（中国）公司提供，胎牛血清胎牛血清购自美国gibco公司，DMEM高糖培养基购自美国gibco公司，青链霉素混合液购自北京索莱宝科技有限公司，胰蛋白酶消化液购自北京索莱宝科技有限公司，牛胰岛素购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，地塞米松购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，油红O购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，4%多聚甲醛固定液购自碧云天有限公司，Triton-X100购自北京索莱宝科技有限公司，DAPI染色液购自北京索莱宝科技有限公司，羊抗兔IgG-FITC购自北京索莱宝科技有限公司，UCP-1、C/EPB-α一抗购自美国Aiffinity公司，羊抗兔IgG-HRP购自北京索莱宝科技有限公司。

1.1.2 细胞株：3T3-L1前脂肪细胞株，购自中国科学院上海生命科学院细胞库。

1.1.3 动物：雌性SD大鼠[许可证号：SCXK（粤）2018-0002]购自广东省医学动物实验中心。

1.2 方法

1.2.1 Pur对3T3-L1细胞脂肪分化影响的实验

1.2.1.1 细胞诱导：使用含10% FBS的高糖DMEM培养基在5% CO2培养箱培养3T3-L1细胞，每天更换培养基，待细胞长满90%，用0.25%胰蛋白酶消化液消化传代。将3T3-L1细胞接种到24孔板、6孔板或者共聚焦小皿中，24h后加入诱导液（含10% FBS、胰岛素20μg/ml、IBMX 1mM，地塞米松2μM的DEME培养基，药物组Pur浓度分别为2.5、5μg/ml），培养48h后更换诱导液（含10% FBS、胰岛素20μg/ml的DEME培养基），培养48h后加入药液（Pur浓度分别为2.5、5μg/ml的10% FBS DMEM培养基），再培养4d，每2d更换一次药液。另设空白组，不加诱导液，2d更换一次培养基。

1.2.1.2 油红〇实验：3T3-L1细胞接种于24孔板中，诱导8d后，去除旧培养基，加入PBS清洗后，加入4%多聚甲醛固定30min，去除多聚甲醛，加入PBS清洗后，加入油红〇染色液染色2h。去除油红〇染色液，用60%的异丙醇洗去浮色，PBS漂洗后在显微镜下观察拍照。

1.2.1.3 Western Blot实验：3T3-L1细胞接种于6孔板中，诱导8d后，去除培养基，加入预冷PBS清洗后，加入RIPA裂解液于冰上裂解10min，10min后转移至离心管，于超声清洗仪中超声4次，每次10s，每次间隔10s。再进行离心，使用BCA试剂盒测定蛋白浓度，调整蛋白浓度后，按比例加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。将稀释好的蛋白样品沸水煮10min，冷却后加入聚丙烯酰胺预制凝胶，特定电压下进行电泳，电泳结束后进行转膜，转膜结束后用5% BSA封闭液，室温封闭2h，封闭后，4℃孵育一抗过夜，一抗孵育后，于摇床上用TBST清洗4次，每次10min，清洗后室温孵育二抗2h。孵育结束后，于摇床上用TBST清洗4次，每次10min。清洗結束后，加入ECL发光液，于全自动数码凝胶图像分析系统进行显影。

1.2.1.4 免疫荧光实验：3T3-L1细胞接种于共聚焦小皿中，诱导8d后，去除旧培养基，加入PBS清洗后，加入4%多聚甲醛固定30min，去除多聚甲醛，加入PBS清洗后，加入5% BSA封闭液，室温封闭2h。封闭后，去除封闭液，加入稀释后的UCP-1或C/EPB-α抗体液，4℃冰箱孵育过夜。过夜后，回收抗体，于摇床上PBS清洗5次，每次5min。清洗后加入稀释后的IgG-FITC工作液，室温避光孵育2h。2h后，去除IgG-FITC，于摇床上避光PBS清洗5次，每次5min。清洗后，加入DAPI染色液染色10min。染色结束后，去除DAPI，于摇床上避光PBS清洗5次，每次5min。清洗后，于荧光倒置显微镜和高分辨率激光共聚焦显微镜下拍照。

1.2.2 Pur对SD大鼠乳房脂肪组织增殖影响的实验

1.2.2.1 造模与给药：SD雌性大鼠于SPF级动物房饲养，分为空白对照组、Bea高剂量组、Bea低剂量组、Pur高剂量组、Pur低剂量组，每组8只。每只大鼠第4对乳房进行脱毛，每天进行涂药，其中空白组涂橄榄油（每只乳房各20μl），Bea高剂量组和Bea低剂量组（每只乳房）分别涂Bea 20、40mg。Pur高剂量组、Pur低剂量组分别涂Pur 20、40mg。连续涂药60d。

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[收稿日期]2020-05-06

本文引用格式：陳宇，温洁仪，韩萍，等.葛根素对大鼠乳房脂肪组织增殖的影响及其机制研究[J].中国美容医学，2021，30（3）：93-98.