风柜斗草醇提物对小鼠酒精性肝损伤的保护作用

华宝玉，陈 津，汪永夫，陈森艳，邱龙新

(1.龙岩学院；2. 预防兽医学与生物技术福建省高等学校重点实验室；3.龙岩市中医院 福建龙岩 364000)

风柜斗草，又名褚红头、肉穗草，属于野牡丹科(Melastomaceae)中的肉穗草属(SarcopyramisWall)。草本，肉质无被毛的四棱茎；卵形叶片对生，叶片顶端渐尖，基部近圆形，边缘细锯齿，叶柄纤细；花紫红色至粉红色，花瓣卵形；蒴果绿色，杯状，有四棱，状如风柜斗，故其名[1]。主要分布东南亚和我国的福建、台湾、广西、广东、江西等地。该植物为我国民间习用，是治疗急慢性肝炎的单验方，疗效确切，安全无毒副作用[2]。其药用价值包括：调节人体免疫机制，增加抗氧化能力，帮助机体清除肝脏代谢产生的毒物，减轻肝脏代谢负担。

酒精性肝病(Alcoholic liver disease, ALD)是由于长期过量饮酒导致的肝脏疾病，是一种临床常见的肝损伤形式，近年来酒精性肝病发病率在我国呈逐年增高趋势，成为仅次于病毒性肝病的第二大肝病，严重危害人民健康[3]。ALD 的发病机制非常复杂，主要是乙醇及其衍生物的代谢过程中直接或间接诱导的炎症反应，越来越多的证据表明氧化应激、肠源性内毒素、炎性介质和营养失衡等多种因素相互作用的结果，脂代谢、肝再生和凋亡、肝脏抗氧化等多种信号转导通路、 肠道菌群紊乱、细胞因子、免疫反应等多种因素也参与 ALD 的发生发展[4]。肝细胞通过乙醇脱氢酶将乙醇转化为乙醛，也可通过细胞色素P4502E1 (CYP2E1)将乙醇氧化为乙醛，接着通过乙醛脱氢酶将乙醛转化为乙酸。肝细胞代谢乙醇时产生大量活性氧，可造成脂质过氧化、线粒体损伤、炎症和凋亡，引起肝损伤[5]。治疗酒精性肝病的方法有营养治疗、药物治疗、肝移植等。但是如果长期服用药物也会有负面作用，如糖皮质激素、美它多幸，会使肝脏代谢负担加重，反而加重病情。郑晓艳等[6]研究分析，风柜斗草醇提物含有多种天然活性物质，如多糖类、氨基酸类、酚类、黄酮类等。这些化合物具有提高免疫调节能力和抗脂质过氧化活性功能，可能对肝脏脂质过氧化，肝细胞膜破损导致的急性酒精肝有一定的预防治疗作用。本研究进一步探讨风柜斗草醇提物对酒精性肝损伤的抗氧化，抗损伤的保护作用和机制，以期为风柜斗草醇提物在酒精性肝病治理药物的开发应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验试剂与动物

风柜斗草(购自龙岩市辖区市场的天然药用植物 , 经龙岩学院孔祥海教授鉴定);谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)检测试剂盒、谷草转氨酶(aspartate transaminase, AST)检测试剂盒、谷胱甘肽过氧化酶(glutathione peroxidase, GSH-PX)检测试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)检测试剂盒、丙二醛(malondialdehyde, MDA)检测试剂盒、蛋白浓度检测试剂盒等购于南京建成生物工程研究所。乙醇、甲醛均为分析纯，由西陇化工股份有限公司生产。健康清洁级ICR种雄性小鼠60只，雌雄各半，体重(20±2) g由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。

1.1.2 仪器设备

旋转蒸发器(东京理化公司)、真空冷冻干燥机(宁波新芝生物科技股份有限公司)、超细匀浆机(上海贝基生物科技公司)、酶标仪(美国Bio-Rad)等。

1.2 实验方法

1.2.1 风柜斗草醇提取物制备

将风柜斗草放入烘箱24 h后，放入粉碎机进行粉碎，经过50目筛子过目收集。称取风柜斗草粉末50 g放入烧杯，加入500 mL无水乙醇，玻璃棒搅拌均匀，放入超声波清洗机1 h，期间每隔10～15 min搅拌一次，至少搅拌3～5次，促进有效成分的溶出；结束后将溶液进行抽滤，收集滤液，滤渣根据上述方法重复提取3次，收集滤液，将其进行旋转蒸发浓缩至无酒精后加入少量蒸馏水收集；最后得到收集的量，放入真空冷冻干燥机，充分干燥，收集到风柜斗草醇提取物。上述提取物临用前捣碎成细粉用蒸馏水溶解配成所需的剂量，灌胃前均匀摇晃。

1.2.2 动物模型的建立及实验设计

小鼠适应性喂养一周后，然后随机分6组，分别为空白组、急性酒精肝模型组、联苯双酯阳性组(200 mg/kg)、风柜斗草醇提物组(低、中、高组剂量分别为200、400、800 mg/kg)且每组10只。在第8 ～ 29天内，每天给小鼠灌胃受试品，每周称两次体重，并根据体重进行调整药量。30 d后，除空白组外其余小鼠灌胃体积分数为50%乙醇(分析纯)，胃灌量为12 mL/kg，空白组给予水，禁食16 h后。通过眼球取血法得到全血，且离心得到血清；采用脊椎脱臼法处死。解剖小鼠得到肝脏分装五份，用于切片及其他的检测。将离心后得到的血清和肝脏置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2.3 肝脏病理学切片制作及观察肝脏变化

将小鼠解剖得到的肝脏切取小块立即用体积分数10%福尔马林固定，进行病理学切片制作，然后观察切片，比对各组小鼠肝脏的病变程度。在每张病理学切片上取5处观察，分别为左上、右上、中间、左下、右下，以平均每个部位空泡所占百分比表示肝脏脂肪变性程度。依据空泡面积占肝组织切片的比例，判断肝脏损伤程度。

1.2.4 血清中ALT、AST含量测定

对小鼠灌胃乙醇以及禁食16 h后，取得全血，常温下放置20 min，设置离心机温度4 ℃，离心(3500 r/min，10 min)得到血清，分装保存于-80 ℃超低温冰箱，按试剂盒操作说明检测ALT、AST含量。

1.2.5 肝组织中GSH-PX、SOD、MDA含量测定

用生理盐水制作10% (m/V)肝组织匀浆液，按采购的试剂盒中步骤测定GSH-PX、SOD。MDA的检测先采用RIPA裂解液制作10%肝组织匀浆液，再用试剂盒对MDA含量的测定。

1.2.6 统计分析

将实验数据进行系统整理。GraphPad Prism 5.0用作统计学分析和处理，且用MeanSEM表示获得的数据，ANOVA-One Way可对多组间进行多重比较。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 病理学切片的观察

由图1得，空白组肝组织表现为正常形式且肝细胞未见肿胀，呈放射状分布，细胞核呈正常圆形状，胞质内几乎没有脂滴；模型组肝细胞变大，圆形脂滴空泡明显增多，存在脂滴的肝细胞数量上升，且肝组织中含有大量的脂滴，细胞质疏松呈网状，说明酒精诱导小鼠急性肝损伤模型建立。阳性对照组中，肝细胞未见明显肿胀，但仍可见少量滴空泡；风柜斗草醇提物低剂量组(200 mg/kg)，圆形脂滴空泡分布范围较广，还存在大量肝细胞脂肪变性；中剂量组(400 mg/kg)，肝细胞脂滴空泡数量明显减少，病变范围缩小，肝细胞结构清晰，治疗效果明显；高剂量组(800 mg/kg)，肝细胞细胞质疏松呈网状，细胞核部分被破坏。与模型组比较，说明低剂量和中剂量组药物组均有减轻脂肪变性和炎症反应的作用，而高剂量组治疗效果不如低剂量和中剂量组药物组。

A:空白； B:模型； C:阳性；D:低剂量组；E：中剂量组；F：高剂量组；图中箭头所示为圆形脂滴空泡图1 风柜斗草醇提物对酒精肝损伤小鼠肝组织病理切片的影响(HE，×200)

表1 各组小鼠血清ALT、AST水平比较

2.2 小鼠血清中ALT、AST检测结果

由于受到刺激因子的作用致使肝细胞膜结构损伤，ALT、AST大量从肝细胞中流出会导致血清中转氨酶活性增加。根据表1，模型组小鼠在酒精刺激下造成了血清中ALT、AST水平升高，与不受酒精刺激的空白组比较有差异极显著(P<0.01)，可以判断实验模型构建成功。阳性组与模型组差异极显著(P<0.01)，表明阳性药物可以稳定肝细胞膜结构，减轻肝损伤。从比较模型组与各剂量组的结果可以看出：剂量为200 mg/kg，小鼠血清中AST水平明显降低(P<0.05)，ALT水平下降；剂量为400 mg/kg，ALT、AST水平显著降低(P<0.01)，得到的效果最佳；剂量为800 mg/kg，显著降低AST水平(P<0.01)，且ALT也明显下降(P<0.05)。因此可以得出风柜斗草醇提物不同剂量的给药方式，所呈现的效果也具有差异。

2.3 小鼠肝组织中GSH-PX、SOD、MDA的检测结果

由表2得，模型组中GSH-PX活力比空白组中低(P<0.05)，因GSH-PX和SOD是主要的抗氧化酶，且SOD能有效降低超氧阴离子含量，防止肝脏受到自由基作用产生损伤；因此模型组GSH-PX、SOD活力明显减小，可以说明肝脏发生损伤，造模成功。阳性药物组和风柜斗草醇提物各剂量组都能提高GSH-PX活力，阳性药物组显著提高(P<0.01)，低剂量组和中剂量组能明显提高GSH-PX活力(P<0.05)；说明风柜斗草醇提物对治疗肝损伤造成抗氧化物活性变化有一定效果，减小肝脏损伤。在比较各组SOD水平，可以看出模型组由于受到外界因子影响导致小鼠肝脏中的SOD活力明显降低；在比较模型组与阳性组时，阳性组在SOD活力提高表现显著(P<0.05)，风柜斗草醇提物各剂量组相对于模型组都有提高SOD活力，其中中剂量组为防止肝脏受到自由基作用造成损伤效果最佳(P<0.05)。

当肝细胞受到外界刺激因子作用时，会导致体内的氧化与抗氧化作用失调，产生大量且作用偏向于发生氧化反应。在肝组织中的脂肪酸会被氧化分解产生许多复杂的物质，其中包含MDA。通常肝脏自由基的产生和机体的过氧化程度可以通过检测MDA的水平来检测。由表2得，从模型组数据可以看出，该组小鼠肝脏中MDA含量平均偏高，与空白组比较有统计学上的差异；从模型组分析中可以得到该组小鼠肝脏中MDA变多，破坏肝功能。对照组MDA含量比模型组中的低，说明联苯双酯可以降低肝脏损伤。各剂量组与模型组比较，MDA水平有所下降，其中低剂量组与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

为研究风柜斗草醇提物的作用机制，本实验采用的是乙醇灌胃制造急性酒精性肝损伤的模型，从模型组小鼠血清中可以检测到大量的AST、ALT。ALT、AST在正常肝细胞中含量较高，血清中含量较少，当肝脏受到损伤时，肝细胞膜结构被破坏导致转氨酶从细胞流出进入血液，通过小鼠血清中ALT和AST活性的高低可判断其肝细胞损伤的程度[7]。检测到给予风柜斗草醇提物后，血清中的AST、ALT水平明显降低，可以判断风柜斗草醇提物可以降低酒精对肝脏损伤程度，提高肝细胞膜的耐受能力，保持膜结构的稳定。对肝组织的检测，风柜斗草醇提物能提高GSH-PX、SOD活力，同时降低肝组织中MDA含量。综合检测数据，低剂量和中等剂量组的效果较好，较低剂量的风柜斗草醇提物可以通过降低脂质过氧化水平以及提高抗氧化酶活性起到保护肝脏损伤的作用[8]。高剂量风柜斗草醇提物因浓度过高超过肝细胞耐受影响了药效，原因可能是当风柜斗草提取物中黄酮的浓度在0.35～0.55 mg /mL 时，对羟自由基清除的效果好，但提高其浓度会降低对自由基的清除率[9]，当风柜斗草醇提取物浓度太高导致其中黄酮含量过高，使得抗氧化效果下降。在对肝组织进行病理学切片观察，可以明显地看出喂食低剂量和中剂量组风柜斗草醇提物的小鼠，在其肝组织中脂滴数量明显减少，肝细胞大小正常及排列整齐，脂肪变性程度降低。综上所述，中、低剂量的风柜斗草醇提物可以通过提高抗氧化酶水平、稳定肝细胞膜结构和降低脂质过氧化水平，从而一定程度减轻小鼠短期大量摄入乙醇而导致的酒精性肝损伤，为临床应用急性肝损伤提供理论基础。上述活性作用可能与其富含黄酮类、多酚、皂苷、还原糖、有机酸等活性成分有关[9-11]。关于风柜斗草醇提物浓度达到何值会造成副作用的毒理学实验以及风柜斗草醇提物化学成分与药效的关系有待进一步研究。