初烤烟叶中烟碱和新植二烯的提取工艺研究

杜 康 张 尉 顾丽莉,* 张 花 黄智华 姚 雯

(1 昆明理工大学化学工程学院，云南 昆明 650500；2 云南省烟草公司玉溪市公司，云南 玉溪 653100)

烟叶中含有300多种化合物，其中主要的生物活性物质，如烟碱、新植二烯、茄尼醇、绿原酸、芦丁、果胶和烟草蛋白等，在化工、医药、农业等多个领域有着广泛的应用[1-2]。新植二烯是具有20个碳原子的聚类异戊二烯类香味物质，是烟叶中重要的致香物质。研究表明，新植二烯主要由天然绿色植物中的叶绿素经降解、转化衍生而来，在烟叶中的质量分数约为0.06%～0.10%[3]。新植二烯作为捕集烟气气溶胶内香气物质的载体，具有携带烟叶中挥发性香气物质和致香成分进入烟气的能力，也是烟叶的重要增香剂[4]，在低温不燃新型卷烟中不可替代。烟碱(nicotine)，又称尼古丁，在烟叶中以(S)-3-(1-甲基-2-吡咯烷基)-吡啶存在，是香烟本身的基本成分之一，具有强烈的生理活性，其最新的应用现状是作为一种新型口含烟的主要添加成分[5]。据报道，烟碱可改善患者的健康状况，如痴呆症、精神分裂症、多巴胺能神经元和轴突、皮肤温和认知功能障碍、左旋多巴诱发运动障碍等。烟碱还具有抗菌作用和杀虫活性，可作为天然杀虫剂[6]，而且具有易降解、对人体无毒等优点。研究发现烟草中的化学成分较复杂，其成分含量受诸多因素的影响，如烟叶品种、种植方式、气候环境和烟叶部位等[7-8]。

常见天然植物成分的提取方法有超声辅助提取法、溶剂提取法和超临界流体萃取法等[9-12]。邓小华[13]采用超临界萃取技术得到萃取产物中新植二烯含量为22.61%；尚宪超等[14]采用深共熔溶剂提取烟叶中烟碱，最佳工艺条件下烟碱得率为22.72 mg·g-1；Hu等[15]采用柱层析萃取法同时从废烟草中提取和分离纯化尼古丁和茄尼醇；杨君等[16]采用超声辅助溶剂法提取烟草精油，检测结果表明烟油中烟碱含量为25.41%、新植二烯含量为38.55%；康明娥等[17]以四氢呋喃为原料，以对甲苯磺酸为催化剂，合成了质量分数为44.17%的新植二烯，但此方法合成路线复杂、易出现异构体。综上，已有提取工艺的目标成分含量低、产品得率低，且以烟碱和新植二烯为目标的提取工艺极少。因此，本试验以云南典型初烤烟叶为原料，采用气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)分析萃取物组成，比较了4种工艺下烟叶精油萃取产物中烟碱和新植二烯的含量，以期确定安全、高效和操作简单的烟叶烟油萃取工艺，为下一步烟碱和新植二烯的分离纯化提供最佳物料。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

初烤烟(C3F k326)取自云南华宁地区。正己烷、乙醇(分析纯)，天津市风船化学试剂科技有限公司；二氯甲烷(分析纯)，四川西陇化工有限公司；三氯甲烷(分析纯)，重庆川东化工有限公司；无水硫酸钠(分析纯)，重庆北碚化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

SFE-500超临界流体萃取设备，美国Thar科技公司；DC-0515低温恒温槽，上海衡平仪器仪表厂；BSA224S电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司；7890A-5975C气质联用设备，安捷伦科技(中国)有限公司；RHP-600高速多功能粉碎机，浙江荣浩工贸有限公司；RE-2000A旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂。

1.3 试验方法

将初烤烟叶粉碎，过60目筛，作为待分离烟叶原料，备用。

1.3.1 溶剂萃取 称取80 g原料，分为4组，每组20 g，分别放入250 mL锥形瓶中，选择无水乙醇、乙酸乙酯、三氯甲烷和正己烷不同极性的溶剂进行萃取。每种溶剂用量100 mL，分别加入装有原料的锥形瓶中，振荡摇匀后密封，静置24 h后，过滤，旋蒸至溶剂完全蒸发，得到黄色油状液体，计算烟油提取得率，并进行成分分析。

按照公式计算烟油提取得率(E)：

E=m/M×100%

式中，m为烟油质量，g；M为烟叶原料质量，g。

同时考察了不同浓度乙醇作为萃取剂时对烟叶精油得率的影响。称取80 g原料，均分为4组，每组为20 g，分别放入250 mL锥形瓶中，选择25%、50%、75%和100% 4种不同浓度的乙醇溶液作为萃取剂进行溶剂萃取，每组溶剂用量100 mL，分别加入装有原料的锥形瓶中，振荡摇匀后密封，静置24 h后过滤，旋蒸，至溶剂完全蒸发，得到黄色油状液体，计算烟油提取得率。

1.3.2 超声辅助萃取 称取20 g原料，置于250 mL锥形瓶中，加入100 mL一定浓度的乙醇。之后进行超声提取，超声功率240 W，温度40℃，超声50 min，然后将提取液密封，静置10 min后过滤，旋蒸除去溶剂，得到黄色油状液体，计算烟油提取得率，并进行成分分析。

1.3.3 索式回流萃取 称取10 g原料装入索氏提取管中，并安装于250 mL圆底烧瓶上，采用200 mL一定浓度乙醇作为萃取剂，热回流温度控制在90℃，回流2次，自然降温后，收集回流液，旋蒸除去溶剂，得到浅黄色油状液体，计算烟油提取得率，并进行成分分析。

1.3.4 超临界CO2萃取 称取60 g原料，置于500 mL超临界CO2萃取罐中，设定操作参数：萃取罐压力30 MPa，萃取温度50℃，CO2流量20 g·min-1，夹带剂无水乙醇流量1 g·min-1，萃取时间2 h；分离罐压力5 MPa，分离温度40℃。试验结束后，从分离罐中接出淡黄色且具有烟草香味的油状液体，计算烟油提取得率，并进行成分分析。

1.4 GC-MS分析

1.4.1 样品前处理 用移液枪量取各萃取物50 μL，并用3 mL二氯甲烷溶解，无水硫酸钠除去水分，用0.22 μm微膜过滤，配成一定浓度的样品，进行GC-MS分析。

1.4.2 GC-MS分析条件 色谱柱：HP-5MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样口温度：250℃；程序升温：柱温 80℃，保持1 min，以5℃·min-1升至200℃，保持3 min；最后以8℃·min-1升至280℃，保持10 min；载气：He；流量1.0 mL·min-1；进样方式：分流进样，分流比50∶1，进样体积：0.2 μL。

离子源：EI源，离子源温度：230℃，四极杆温度：150℃；电离能：70 eV，全离子扫描检测质量数范围50～550 amu, 溶剂延迟：3 min。

1.5 数据分析与统计

采用Origin 2018软件对数据进行分析并制图。

2 结果与分析

2.1 乙醇浓度对萃取烟油得率的影响

由图1可知，当以无水乙醇作为萃取剂时，3种萃取方法的烟油得率接近，且均较低，然而索式回流萃取法的烟油得率略高于溶剂萃取和超声辅助萃取法；含水乙醇作为萃取剂时，超声辅助萃取和溶剂萃取法的烟油得率远高于索式回流萃取法，而超声辅助萃取法的烟油得率又略高于溶剂萃取法；当乙醇浓度为50%时，3种萃取方法的烟油得率均比其他乙醇溶液组高。这可能是由于水分子的极性大于乙醇分子，随着含水量的增加，其极性变大，烟叶中极性较大的水溶性物质会更多地被萃取出来，如油脂、类脂磷脂、蜡质、树脂等[18-19]，致使烟油得率提高。与醇浓度为50%相比，乙醇浓度为25%时，烟油得率略有下降，说明极性大的溶剂不利于极性较小物质的溶出。试验过程中发现，当选用二氯甲烷作为稀释剂时，只有100%乙醇萃取下的烟油能完全溶解，50%、75%乙醇水溶液萃取出的烟油只有少量能溶解，25%乙醇水溶液萃取的烟油几乎不溶于二氯甲烷。因此，在水存在的萃取环境下，烟油得率提高的原因在于烟叶中水溶性蜡质类物质被萃取出来。结合GC-MS分析结果，烟油得率的提高对烟碱和新植二烯的含量变化几乎无影响。故采用纯乙醇作为萃取溶剂，其得到的烟油将有利于后期烟碱和新植二烯的分离和检测。

2.2 有机萃取剂的极性对烟油得率的影响

采用溶剂萃取方法，选择4种不同极性的萃取溶剂：乙醇、乙酸乙酯、三氯甲烷和正己烷(极性大小顺序为乙醇>乙酸乙酯>三氯甲烷>正己烷)，比较不同极性大小萃取剂对烟油得率的影响。

由图2可知，随着溶剂极性的降低，其烟油得率呈下降趋势，萃取剂的极性对烟油得率确有影响。另外，当以三氯甲烷作为萃取剂时，本试验烟油得率高于文献[20]的烟油得率，可能是烟叶原料来自不同地区或方法不同所致。

图2 不同极性溶剂下烟油的得率

2.3 不同萃取方法对烟油得率的影响

由图3可知，不同萃取方法下烟油得率差异较大，4种萃取方法烟油得率由高到低依次为索式回流萃取>超声辅助萃取>溶剂萃取>超临界CO2萃取。虽然索式回流萃取烟油得率最高，但索式热回流萃取存在温度过高可能会导致萃取物中热敏性物质分解或变性的缺点，因此，萃取过程中应控制操作温度，防止烟油中的成分分解或变性；超声辅助萃取油烟得率高于乙醇溶剂萃取，再次表明，超声破壁作用不仅能缩短萃取时间[21]，而且能提高烟油得率。但溶剂萃取和超声辅助萃取都存在溶剂残留、萃取物中杂质较多的缺点，而且可能会增加目标物质的分离难度；超临界CO2萃取虽然得率最低，但该方法具有溶剂与萃取物可完全分离、无溶剂残留、操作温度低和萃取时间短等优点[21-22]。针对烟碱和新植二烯的分离，需对上述萃取产物的成分进行分析，烟油得率结合萃取物中二者的相对含量选择最佳的提取方法。

图3 不同萃取方法的烟油得率比较

2.4 萃取产物中的主要成分

2.4.1 超临界CO2萃取产物成分 将超临界CO2萃取物进行GC-MS分析，以峰面积归一法测得萃取物中各组分的相对含量，其总离子流图如图4所示。

对总离子流图中的各峰经质谱扫描后得到质谱图，经过质谱数据(NIST)系统检索，确定烟叶萃取物中含有52种化合物，图4中的7个峰对应的主要成分总占比达到86.53%，其化合物及相对含量见表1。

2.4.2 超声波辅助萃取产物成分 图5是超声波辅助乙醇萃取初烤烟叶产物的GC-MS总离子流图，可确定萃取物中含47种化合物，6个峰对应的6种化合物相对含量总占比为86.00%，其化合物和相对含量见表2。

2.4.3 索式回流萃取产物成分 乙醇作为萃取剂，采用索式回流萃取，其萃取产物的GC-MS总离子流图如图6所示。由检测数据可知，共有化合物40种，只有1个主峰，其保留时间为13.643 min，对应物质为(S)-3-(1-甲基-2-吡咯烷基)-吡啶(烟碱)，其相对含量达75.58%。

图4 超临界CO2萃取初烤烟叶产物的成分总离子流图

表1 超临界CO2萃取产物的主要成分

表2 超声辅助萃取物的主要成分

图5 超声波辅助萃取初烤烟叶产物中成分的总离子流图

图6 索式回流萃取初烤烟叶产物成分的总离子流图

2.4.4 乙醇溶剂萃取物成分 以乙醇为萃取剂，采用溶剂萃取，其萃取物的GC-MS总离子流图如图7所示。萃取物中共检出46种物质，谱图中只有1个主峰，其保留时间为20.784 min，对应物质为新植二烯，其相对含量为45.20%。

图7 乙醇溶剂萃取初烤烟叶产物成分的总离子流图

由表3可知，不同萃取剂和萃取方法下得到的烟油中成分相差较大。索式回流萃取的烟叶精油，不仅烟油得率高，而且烟油中烟碱含量最高，可作为最佳初提物用于烟碱的进一步提纯；乙醇溶剂萃取的烟叶精油得率高于相同萃取方法下采用其他萃取溶剂的得率，且烟油中主要成分为新植二烯，利于进一步纯化新植二烯。

2.5 烟碱和新植二烯相对含量比较

图8 萃取物中烟碱和新植二烯相对含量比较

结合2.4中萃取产物化学成分分析和表3，不同萃取剂和萃取方法的烟油得率、含有的总物质数和主要化合物的相对含量均有较大差异。低极性的溶剂萃取，如用正己烷、三氯甲烷萃取的产物中有100多种化合物，但主要化合物只有6～9种，其相对含量总占比分别达到66.23%和78.28%，说明烟草中较多小极性的物质易在低极性溶剂萃取出，但这些物质的含量均较低，符合相似相溶原理，并且与文献[24-25]结果一致。乙醇索式回流萃取烟油得率较高，萃取产物中主要物质为烟碱，说明适当的加热有利于烟碱的提取。从表3来看，超临界CO2萃取和乙醇超声辅助萃取所得到的萃取产物中化合物总数基本相同，但主要成分的相对含量存在一定差异。乙醇溶剂萃取与乙醇超声辅助萃取结果相比，超声辅助不仅能提高烟油得率，而且有更多的物质被萃取出。由此可见，一定功率的超声作用增强了烟叶植物细胞壁破裂的程度，更有利于物质溶出，使其有效成分更多地被萃取出来[26]。由图8可知，不同萃取方法得到萃取产物中烟碱和新植二烯的相对含量有所不同，乙醇索式回流萃取产物中烟碱相对含量最高，达到75.58%；乙醇溶剂萃取产物中新植二烯相对含量最高，为45.20%。

表3 不同萃取剂和萃取方法的结果汇总

3 讨论

本研究以云南典型初烤烟叶为原料，探究不同萃取方法下的烟油得率，并对萃取得到的烟油进行GC-MS检测，确定烟油中的主要成分，最后以烟碱和新植二烯相对含量为目标，确定最优的提取工艺。

溶剂萃取中，随着萃取剂极性的增大，即正己烷<三氯甲烷<乙酸乙酯<乙醇，烟油中烟碱相对含量先增大后减小，三氯甲烷作为萃取剂的烟碱相对含量最高，达到31.19%，这与烟碱分子中N原子的存在形式、官能团极性大小等密切相关，在烟碱分子结构中，有以单键相连的2个含氮杂环-吡啶环和吡咯环，这2个杂环胺的官能团均属叔胺型[27]，极易溶于氯仿、卤代烷烃等低极性溶剂；随着萃取剂极性的增大，新植二烯的相对含量先减小后增大，其中乙醇作为萃取剂其相对含量最高，达到45.20%，这与新植二烯具体形成的过程有关，因为其在烟叶调制陈化过程中先由叶绿素降解产生叶绿醇(植醇)，进而由叶绿醇脱水而形成含有20个碳原子的聚类异戊二烯，除此以外，裂解产物中还有大量的醇类酯类物质产生[28]，而乙醇作为一种极性较为适合、无毒无害的醇类萃取剂，有较好的相似相溶性，从而达到良好的萃取效果。

本研究在超临界CO2流体萃取过程中使用乙醇作为夹带剂，扩展了萃取剂的极性范围，即从CO2的非极性延伸到少量乙醇介入的弱极性，兼顾了非极性长链烯烃新植二烯和弱极性含2个杂环胺官能团的烟碱，使新植二烯和烟碱均可有效萃取出。乙醇超声辅助萃取法得到的萃取产物中，烟碱(32.28%)和新植二烯(28.24%)的相对含量与文献[16]基本一致(烟碱25.4%，新植二烯38.55%)。乙醇索式回流萃取法得到烟油中烟碱相对含量最高(75.58%)，经考察，这与萃取温度有关，升温有利于增大溶质的溶解度和传质速率，适当加热既保持了烟碱的稳定性，又提高了其在乙醇中的溶解度，使得烟油中烟碱的相对含量较高。以上对初烤烟叶中烟碱和新植二烯提取工艺的研究，将有利于深入探究高纯度烟碱和新植二烯产品的分离。

4 结论

本试验研究了超临界CO2萃取、超声辅助萃取、索式回流萃取和溶剂萃取4种方法提取云南典型初烤烟叶精油的工艺，考察了不同萃取方法下的烟油得率，并确定了针对烟碱和新植二烯的最佳初提方法。结果表明，乙醇作为萃取剂时，索式回流萃取烟叶精油得率最高，且烟油中烟碱的相对含量最高，可以作为进一步分离纯化烟碱的初级提取过程；在溶剂萃取过程中，以乙醇为萃取剂的提取效果好于其他萃取剂，其烟油得率高，且新植二烯含量最高。因此，乙醇溶剂萃取可选为分离纯化新植二烯的较佳初级提取工艺。本研究为云南初烤烟中烟叶精油及烟碱和新植二烯的提取过程提供了参考依据和可行性良好的多种工艺途径，且其乙醇索式回流萃取和乙醇溶剂萃取下的初提物可作为下一步高纯度烟碱和新植二烯的较佳纯化原料。