利用aiiA基因筛选抗烟草青枯病生防菌株及其鉴定

郑钰婷 胡宇如 胡方平 蔡学清

(福建农林大学植物保护学院，福建 福州 350002)

作物青枯病是由青枯雷尔氏菌(Ralstoniapseudosolanacearum)引起的一种典型的细菌性维管束病害，是农作物特别是茄科作物如番茄、辣椒、马铃薯和烟草等生产上的重要限制因子，造成了不可挽回的经济损失[1-3]。目前作物青枯病的防治方法包括农业防治[4]、化学防治[5]及生物防治[6]等，其中化学防治是主要的防治方法之一，但化学防治易使病菌产生抗药性且易造成环境污染[7]；生物防治具有无污染、无公害、经济长效等优点，逐渐成为研究的热点[8]，但如何高效筛选并获得有用的生防细菌是植物病理学家一直探讨的问题。

目前最常用的筛选方法是室内平板筛选，这种筛选方法比较省时快速，但室内平板筛选结果与盆钵及田间的防效不一定成正比[9-10]。其次，田间防效测定筛选较常用，该方法获得的菌株比较可靠，但工作量大且时间长。已有研究发现，细菌中普遍存在群体感应(quorum-sensing，QS)现象，它们通过感应特定信号分子浓度变化来感知周围环境中自身或其他细菌的数量，并调整相关基因表达以适应环境变化[11-12]。许多重要生物学功能如致病因子的表达、色素的产生、抗生素的合成和生物群游现象等都会受到QS系统的调控[13-14]，上述调控均通过各种信号分子来完成。据报道，革兰氏阴性细菌中的QS系统信号分子大多为N-酰基高丝氨酸内酯(N-acylhomoserine lactones，AHL)[15]，因此AHL信号分子可作为防治植物细菌病害的新靶标位点；将其破坏后可抑制细菌QS系统的调控，其相对应的细菌生物学功能基因就会受到抑制，这种对细菌QS调控机制的干扰和破坏称为群体感应淬灭 (quorum quenching，QQ)[16]。如芽胞杆菌属(Bacilllus)中就含有N-酰基高丝氨酸内酯酶基因(autoinducer inactivation gene，aiiA基因)，其编码的AiiA蛋白能水解欧文氏菌(Erwinia)产生的AHLs信号分子的内酯环，使其失活，从而抑制其致病基因的表达，降低病原菌的致病性[17]；陈珺君等[18]将aiiA基因导入多黏芽胞杆菌(Paenibacilluspolymyxa)NR1后，发现其对胡萝卜欧文氏菌(E.carotovora)具有一定的抗菌活性，证明含有aiiA基因的生防细菌对具有AHL群体感应调控系统的植物病原细菌具有抑制作用。

作物青枯病菌具有典型的AHL群体感应调控系统[19-20]，因此本研究拟通过aiiA基因引物进行PCR扩增快速筛选具有aiiA基因的生防细菌菌株，进一步结合室内盆钵防效测定获得具有防效的生防细菌菌株，并明确其分类地位，旨在为田间作物青枯病的生物防治提供菌株资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株：烟草青枯病菌(R.pseudosolanacearum)Z5由福建农林大学植物细菌实验室分离鉴定及保存；枯草芽胞杆菌(B.subtilis) 标准菌株BS168和生防菌株由福建农林大学植物细菌实验室保存。

供试烟草品种：翠碧1号，由福建省三明市烟草公司提供。

1.2 主要仪器与设备

TProfessional Standard Gradiena96 PCR仪，德国耶拿分析仪器股份公司；Fire-readerV4型凝胶成像仪，英国UVItec公司；DYY-6C型电泳仪，北京六一仪器厂；ZHWY-211B型摇床，上海智城分析仪器制造有限公司；PRX-350B型恒温培养箱，宁波赛福实验仪器有限公司；BioDrop Duo型超微量核酸蛋白分析仪，英国Biochrom(柏楉)有限公司；YXQ-LS-50G高压灭菌锅，上海博迅实业有限公司；AB104-N型电子分析天平，梅特勒托利多仪器公司。

1.3 细菌的培养方法

生防细菌的培养：取-75℃冷冻保存的待测菌株在营养琼脂(nutrient agar，NA)平板培养基[21](牛肉浸膏3.0 g、酵母浸膏1.0 g、葡萄糖1.0 g、蛋白胨5.0 g、琼脂15.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH值7.2)上活化，然后置于37℃恒温培养箱中培养24～48 h，挑取单菌落于未加琼脂的NA培养基中振荡培养(37℃，180 r·min-1)48 h，用无菌水将其浓度稀释到OD600值为1.0，备用。

青枯病菌的培养：取-75℃冷冻保存的待测细菌菌株在氯化四唑(tetrazolium chloride medium, TZC)[21](蛋白胨10. 0 g、葡萄糖5.0 g、干酪素1.0 g、琼脂15.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH值7.2)平板培养基上活化，然后置于28℃恒温培养箱中培养24～48 h，挑取单菌落于未添加琼脂的NA培养基中振荡培养(28℃，180 r·min-1)24～48 h，用无菌水将其浓度稀释到OD600值为0.8， 备用。

1.4 含aiiA基因菌株的筛选

采用菌落PCR扩增法，引物aiiA1/aiiA2序列及其 PCR扩增体系参照黄天培等[22]的方法。

1.5 生防菌株对烟草青枯病的盆栽防治试验

1.5.1 烟苗培育 将烟草种子播入穴盘中，7～10 d出芽，待长到4～5片真叶时进行试验。

1.5.2 接种方法 设计以下4个接种处理：处理1：无菌水对照(control，CK)；处理2：烟草青枯病菌菌液；处理3：生防细菌菌液+烟草青枯病菌菌液；处理4：化学药剂(氢氧化铜1 000×)+烟草青枯病菌菌液。采用伤根浇灌法，即处理1和处理2的烟苗浇灌接种30 mL无菌水，处理3的烟苗浇灌接种30 mL生防细菌菌液，处理4的烟苗浇灌接种30 mL化学药剂(氢氧化铜1 000×)，24 h 后，处理1的烟苗浇灌接种30 mL无菌水，其余处理分别浇灌接种30 mL烟草青枯病菌菌液。

每个处理设3次重复，每次重复6株烟草苗。待烟株发病后，每隔7 d调查病情，病情分级标准及病情指数计算参照《GB/T 23222-2008烟草病虫害分级及调查方法》[23]。

病情指数=∑﹙各级症状代表值×株数﹚/﹙最高级症状代表值×总株数﹚×100

(1)

防治效果=[﹙对照的病情指数-处理的病情指数﹚]/对照的病情指数×100%

(2)。

1.6 生防菌株的鉴定

1.6.1 生理生化测定 以枯草芽胞杆菌(B.subtilis) 标准菌株BS168为对照菌株，参照东秀珠等[24]的方法进行菌落形态特征观察、革兰氏染色反应、耐盐性和运动性测定、液体培养物静置观察试验、柠檬酸盐利用测定、丙二酸盐利用测定、糖类利用测定、淀粉水解测定、接触酶测定、甲基红试验、V-P试验和七叶灵水解试验。

1.6.2 分子生物学鉴定 采用细菌基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取生防菌株的基因组DNA，使用16S rDNA通用引物27F/1492R[25]和gyrB基因特异引物[26]进行PCR扩增，扩增产物送上海生物工程有限公司测序，序列通过NCBI在线比对，利用 Mega 7.0软件构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 含aiiA基因生防细菌的筛选结果

使用aiiA基因特异性引物对供试的253株菌株进行PCR扩增，其中有12株菌株扩增出单一、清晰的目标条带，大小为750 bp(图1)，与目标条带预期大小相近，表明这12株菌株含有aiiA基因，分别为Syy9、X2、X4、Gbb5、Syb3、B15、F47、F11、F24、BL3、F96和Y3菌株。

注：M: DL 2 000 marker；1：无菌水；2～13生防菌株。

2.2 生防细菌对烟草青枯病的防治效果

采用伤根接种法测定供试菌株对烟草青枯病的防治效果，结果表明，供试的生防细菌(Syy9菌株除外)对烟草青枯病均有一定的防治效果，未经生防细菌处理的烟苗在接种烟草青枯病菌后5 d开始发病，而生防细菌处理过的烟苗在接种烟草青枯病菌后7 d开始发病。其中接种处理后7 d，对烟草青枯病的防治效果大于60%的菌株有6株，F47、B15和X2菌株接种处理的防治效果大于90%；接种处理后14 d，防治效果大于等于60%的菌株仍有2株，分别为B15和Gbb5，此时只接种烟草青枯病菌的烟苗病情指数为83.33，而防治效果较好的生防细菌菌株B15和Gbb5处理的烟苗病情指数分别为26.39和33.33，防治效果分别为68.33%和60.00%。与化学药剂氢氧化铜(1 000×)的防治效果无显著差异；接种处理后21 d，生防细菌B15菌株处理的防治效果仍有44.45%，显著高于化学药剂氢氧化铜(1 000×)处理的防治效果(表1、图2)。根据以上生防菌株对烟草青枯病的防效测定结果可知，菌株B15对该病害的防治效果最好，下面对该菌株的分类地位进行探讨。

注：A：无菌水对照；B：烟草青枯病菌菌株Z5；C：化学药剂Cu(OH)2；D：生防菌株B15。

表1 生防细菌对烟草青枯病的防治效果

2.3 生防菌株生理生化测定结果

B15在NA平板培养基上培养48 h后，其菌落呈圆形，白色，表面有光泽且粗糙，革兰氏染色呈阳性，菌体为杆状。该菌株可利用淀粉、柠檬酸盐、阿拉伯糖、丙三醇、海藻糖、甘露醇、乳糖、山梨醇、纤维二糖、麦芽糖和木糖，不能利用丙二酸盐、甜醇和香叶醇，耐盐性为7%，七叶灵试验呈阳性，接触酶测定、甲基红试验、V-P试验均显示为阴性。

表2 菌株B15的生理生化测定结果

图3 基于16S rDNA构建的系统发育树

图4 基于gyrB基因构建的系统发育树

2.4 分子生物学鉴定结果

用16S rDNA通用引物27 F/1492和gyrB基因特异引物UP-1/UP-2分别对菌株B15进行PCR扩增，获得大小分别为1 553 bp和1 234 bp的序列片段。利用NCBI进行在线比对，分别采用邻接法(neighbor-joining, NJ)和最大似然法(maximum likelihood, ML)构建16S rDNA和gyrB基因的系统发育树(图3、4)。结果显示，菌株B15与蜡样芽胞杆菌(B.cereus)聚为一支。两者遗传距离最近，将其鉴定为蜡样芽胞杆菌(B.cerens)。

3 讨论

青枯病是农作物一类典型的土传维管束病害，危害重，防治难。近年采用化学防治所导致的病菌抗药性及环境污染问题越来越突出，因此，生物防治正成为研究热点，而快速获得高效抑菌作用的生防菌株是提高生防效果的前提。对于作物青枯病菌生防细菌的筛选，目前采用最多的筛选方法是在琼脂培养基上选出抑菌圈较大的菌株，这种筛选方法可省时、快速获得具有抑菌作用的生防细菌，但在室内离体条件下生防细菌抑制病原菌的能力与在盆钵及田间条件下活体抑制该病菌所致病害的能力不一定成正比，因此平板产生的最大抑菌圈的菌株并不一定是盆栽或田间防效最好的生防菌株[27]。如郑雪芳等[28]采用抑菌圈法从不同地理来源的芽胞杆菌中筛选出24株对青枯雷尔氏菌具有拮抗作用的菌株，其中菌株FJAT-11709对青枯雷尔氏菌的抑菌能力(抑菌圈直径14.78 mm)较菌株FJAT-20261(抑菌圈直径14.15 mm)强，但其对番茄青枯病的防效(13.97%)却比菌株 FJAT-20261的防效(72.73%)差。何玉安等[29]采用抑菌圈法筛选出2株抗青枯病菌的菌株，其中LSN02的抑菌能力(抑菌圈直径29.96 mm)较菌株 LLGJ04(抑菌圈直径38.65 mm)弱，但用不同浓度的LSN02 菌液处理烟草时，烟草青枯病的病株率均低于菌株 LLGJ04。这种筛选方法的确可以获得有用的生物因子，但工作量大且耗时长。近几年研究表明，群体淬灭通过阻断微生物间的信号交流，可使其成为“聋哑”个体[30]。其中利用群体感应淬灭酶(quorum quenching enzymes)降解微生物信号分子是目前毒性最小、最为安全有效的群体感应淬灭途径，由aiiA基因编码的群体感应淬灭酶——AiiA酶，可通过降解信号分子AHLs，减轻或消除病原菌的致病性，从而达到防治动植物病害的目的[31-32]。如Qian等[33]将aiiA基因转化生防细菌产酶溶杆菌(Lysobacterenzymogenes)OH11菌株后，获得的突变株具有抑制植物软腐病病原果胶杆菌(Pectobacteriumcarotovorum)的能力，并能够减轻其在大白菜和仙人掌上造成的软腐症状。Anandan等[34]发现含有aiiA基因的内生苏云金芽胞杆菌(B.thuringiensis)菌株KMCL07对铜绿假单胞菌PAO1具有群体淬灭活性。本研究中所用的aiiA基因扩增引物是由黄天培等[22]根据aiiA基因完整的开放阅读框设计的一对简并引物aiiA1/aiiA2，该引物可扩增不同种芽胞杆菌的aiiA基因，如蜡样芽胞杆菌(B.cereus)[35]、苏云金芽胞杆菌(B.thuringiensis)[35]、枯草芽胞杆菌(B.subtilis)[36]等，这些菌株能够减轻由胡萝卜果胶杆菌(P.carotovorum)引起的软腐症状。因此利用PCR扩增的方法筛选具有aiiA基因的生防细菌，不仅可以缩短生防细菌的筛选时间，还能防止室内平板抑菌能力弱或无拮抗能力却具有生防效果的菌株被遗漏。

本研究采用aiiA基因的简并引物PCR扩增获得的12株菌株，盆栽防病试验结果表明，这12株菌株对烟草青枯病均有一定的防治效果，其中一株鉴定为蜡样芽胞杆菌(B.cereus)的B15菌株在室内盆钵条件下对烟草青枯病的防治效果最好，接种处理后14 d时对烟草青枯病的防治效果为68.33%；该菌株由于含有aiiA基因，推测其可能通过合成AiiA蛋白降解青枯病菌体内的群体感应信号分子 AHLs蛋白，从而降低烟草青枯病菌的致病力；另外，该菌株从福建农林大学植物细菌实验室构建的内生细菌库中筛选获得，由于植物内生细菌存在于植物体内, 受到植物体的保护，不易受外界环境的影响，且能在植物体内定殖传导, 可长期发挥作用。本研究为作物青枯病生物防治提供了新的生防菌株资源，但关于该菌株的安全性、内生定殖和防病机制等问题仍需进一步深入探讨。

4 结论

本研究使用简并引物aiiA1/aiiA2扩增获得12株具有aiiA基因的生防细菌，进一步通过室内盆钵防效测定，获得一株对烟草青枯病具有较好防治效果的生防细菌菌株B15，该菌株处理后使烟草青枯病推迟2 d 发生，接种处理14 d后，对烟草青枯病的防治效果为68.33%。根据其菌落形态特征、革兰氏染色反应、生理生化特性以及16S rDNA和gyrB基因序列分析，确认为蜡样芽胞杆菌(B.cereus)。本研究筛选获得的菌株可为作物青枯病的生物防治提供新的菌株资源。