北京、山东、陕西部分地区番茄褐色皱纹果病毒的检测及同源性分析

高文征 范丽娜 李晓东 陈一帆 邱卓瑶 黄泽军 李君明舒金帅刘磊 国艳梅 杜永臣 王孝宣*

（1 中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2 西安金鹏种苗有限公司，陕西西安 710018）

番茄褐色皱纹果病毒（tomato brown rugose fruit virus，ToBRFV）是帚状病毒科（Virgaviridae）烟草花叶病毒属（Tobamovirus）病毒。ToBRFV基因组全长6 392 nt，是正义链RNA 病毒，包含4 个开放读码框（ORFs）：ORF1 和ORF2 编码病毒复制相关蛋白，ORF3 编码运动蛋白（MP），ORF4 编码衣壳蛋白（CP）（Salem et al.，2015）。ToBRFV 可导致番茄花叶、深绿色突起、叶片狭窄，叶脉黄化严重时坏死，花和果实数量减少，果实着色不均或出现黄色、褐色斑块，果实变小，出现皱纹，发病严重时果梗坏死，严重影响番茄果实的品质和商品性（张宇 等，2020）。通常情况下，选育含有Tm-2和Tm-22抗性基因的番茄品种可以抵御烟草花叶病毒属病毒如烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV）和番茄轻斑驳病毒（tomato mild mottle virus，ToMMV）等对番茄的危害，但研究结果表明含有Tm-22基因的番茄品种对ToBRFV 表现为感病，ToBRFV 已在国际上引起了广泛的重视，目前欧洲植物保护组织（EPPO）已经将其添加到警戒名单（Weber &Pfitzner，1998；de Ronde et al.，2014；Luria et al.，2017）。

ToBRFV 于2015 年在约旦被首次发现（Salem et al.，2015），2017 年在以色列被报道（Luria et al.，2017）。此后ToBRFV 在土耳其、德国、英国、意大利、美国、墨西哥等多个国家相继发生，其范围已遍布欧洲、美洲和亚洲（Salem et al.，2015，2019；Luria et al.，2017；Alkowni et al.，2019；Fidan et al.，2019；Ling et al.，2019；Menzel et al.，2019；Panno et al.，2019；Rodríguez-Mendoza et al.，2019；Skelton et al.，2019）。2019年我国山东报道了ToBRFV 的发生（Yan et al.，2019）。中国农业科学院蔬菜花卉研究所番茄育种团队2019—2020 年在北京南口、陕西白水、山东寿光发现了多份疑似感染ToBRFV 的植株，表现为果实上出现着色不均或黄色、褐色斑块，果实变小，出现皱纹。本试验通过对北京、山东和陕西的22份感病样品进行ToBRFV检测，发现7份阳性样品，对7 份阳性样品的保守结构域ORF2 即RdRP基因进行RT-PCR 扩增检测及测序，并进行ToBRFV的进化关系分析，拟为ToBRFV 的有效防治提供参考，且为进一步进行抗性材料筛选及抗性基因挖掘提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品采集 参试22 份材料分别于2019 年和2020年收集于北京南口、山东寿光和陕西白水（表1）。

表1 参试材料的地理来源及品种特征

1.1.2 生化试剂和菌株、载体 RNA 提取试剂盒为北京华越洋生物科技有限公司的Quick RNA Isolation Kit，反转录试剂盒为ABM 公司的OneScript®Plus cDNA Synthesis Kit，高保真酶为南京诺维赞生物科技有限公司的2× Phanta®Max Master Mix（Dye Plus），DNA 凝胶回收试剂盒为北京擎科新业生物技术有限公司的TSINGKE GE0101-200，克隆载体pMD18-T Vector Cloning Kit、DH5α 感受态细胞均由唯地2nd lab 提供。分子量标准DNA Marker Ⅲ由天根生化科技有限公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1 番茄果实总RNA 的提取及RT-PCR 扩增检测 使用RNA 提取试剂盒提取番茄果实总RNA。取疑似感病番茄果实样品3 个，在果实中间部位横切，除去胶质，取面积为1 cm × 1 cm 的外果皮，切成3 mm × 3 mm 的小碎块，用液氮迅速冷却，置于研钵研磨。取50～100 mg 研磨后的样品于2 mL 无酶离心管中，依照试剂盒提取说明步骤提取总RNA，保存于-80℃冰箱，用于后续试验。以番茄果实总RNA 作为模板，使用反转录试剂盒反转录合成cDNA。利用RTPCR 技术对ToBRFV 进行检测，以cDNA 为模板，利用已发表的ToBRFV 检测引物F-3666（5′-ATGGTACGAACGGCGGCAG-3′）与R-4718（5′-CAATCCTTGATGTGTTTAGCAC-3′）进行RT-PCR 扩增（Luria et al.，2017）。扩增体系50.0 μL，包括cDNA 2.0 μL，2× Phanta®Max Master Mix（Dye Plus）25.0 μL，上下游引物各2.0 μL，灭菌水19.0 μL。反应程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性15 s，63 ℃退火15 s，72 ℃延伸40 s，35 个循环；72 ℃终延伸5 min。PCR 产物经3%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.2 ToBRFV 的RdRP基因扩增、序列克隆及测序 ORF2 是ToBRFV 的保守结构，编码1 个RdRP。使用ToBRFV 保守结构域RdRP特异性引物F-3666 与R-4718 对其进行扩增，并克隆测序（Luria et al.，2017）。RT-PCR 扩增体系和反应程序同1.2.1。PCR 产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用凝胶回收试剂盒回收目的谱带，回收产物克隆到pMD18-T Vector 上。转化到大肠杆菌DH5α，经验证选取5 个阳性克隆，再分别选取3 个谱带最明显的阳性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.2.3 序列分析 将得到的RdRp基因序列在NCBI网站中进行分析比对，根据比对结果，选取NCBI上已发表的ToBRFV 分离物的RdRp基因完整序列8 份。利用DNAStar 中的MegAlign 软件对选定的序列进行同源性比对，利用Mega X 软件的Clustal W 法进行多序列比对分析以及邻接法（neighborjoining，NJ）构建系统进化树，系统进化树中各分支置信度（bootstrap）设置为1 000 次重复。

2 结果与分析

2.1 ToBRFV 的RT-PCR 扩增检测结果及感病番茄症状

利用ToBRFV 的特异性引物F-3666 和R-4718对22 份样品进行RT-PCR 检测，结果从7 份样品（19g-273、19g-770、19g-850、19g-946、20g-212、20g-311 和20-YL）中检测出分子量为1 052 bp 的ToBRFV 特异谱带（图1），其余15 份样品没有检测出相应的谱带。其中从北京样品中检测出5份阳性样品，从山东和陕西样品中各检测出1 份阳性样品。

上述结果表明ToBRFV 已在北京、山东及陕西出现。健康番茄果实表面光滑，着色均匀，色泽鲜亮（图2-A），轻度感染ToBRFV 的植株表现为果实着色不均（图2-B～2-D），随着感染程度的加重，果实表面出现黄色或褐色斑块，并出现皱纹（图2-E～2-G），发病严重时果实严重着色不均并伴有黄色或褐色斑块，果实表面皱纹加重，完全失去商品价值（图2-H）。

2.2 ToBRFV RdRP 基因序列分析

将来自北京、山东、陕西的7 份感病材料的ToBRFVRdRP基因序列与亚洲、欧洲、美洲的7个国家8 份ToBRFVRdRP基因序列（表2）进行序列同源性分析及进化树构建。结果表明，来自陕西白水、山东寿光和北京南口的7 份材料的ToBRFVRdRP基因同源性较高，来自亚洲、欧洲、美洲的其他8 份ToBRFVRdRP基因之间同源性较高，而北京、山东及陕西的7 份ToBRFVRdRP基因和来自其他国家的8 份ToBRFVRdRP基因之间同源性较低。

系统进化分析结果表明，2020 年来自陕西的感病材料20-YL 与2019 年来自北京的感病材料19g-946、19g-850、19g-770 的亲缘关系比2019 年来自山东的感病材料19g-273 更近。2020 年来自北京的感病材料20g-212 和20g-311 与2019 年来自北京和山东、2020 年来自陕西的感病材料19g-273、19g-770、19g-850、19g-946、20-YL 处于2个分支，且与20-YL 亲缘关系最远。来自北京、山东和陕西的7 份感病材料的ToBRFVRdRP基因与其他国家的8 份ToBRFVRdRP基因在进化树上处于2 个分支（图3）。北京、山东及陕西的ToBRFV 起源于何处有待进一步研究。

3 讨论与结论

ToBRFV 自首次被发现以来，迅速在全球传播。欧洲植物保护组织（EPPO）已经将其添加到警戒名单。本试验结果表明，ToBRFV 在北京、山东及陕西都已发生，说明ToBRFV 已经开始在国内多地传播，必须引起足够的重视。2019 年在山东报道的ToBRFV 序列与ToBRFV-IL 和ToBRFV-Jo的亲缘关系分别为99.91%和99.86%（Yan et al.，2019），而此次来自北京、山东及陕西的7 份感病材料ToBRFV 序列与ToBRFV-IL 和ToBRFV-Jo的亲缘关系均小于90%，而同一取样点不同年份感病材料的序列也有差异，这可能与不同年份种植材料的引种地不同有关，关于ToBRFV 在国内传播的起源有待进一步研究。

目前ToBRFV 的防治方法主要有物理防治和化学防治。物理防治主要是进行轮作，如茄子、马铃薯等作物对ToBRFV 表现抗性，可以将番茄与大蒜、马铃薯、茄子等进行轮作，以缓解ToBRFV 带来的危害（Luria et al.，2017）。化学防治手段主要是喷洒病毒抑制剂，如20%吗胍·乙酸铜可湿性粉剂、0.5%氨基寡糖素水剂、8%宁南霉素水剂等（杨芳，2018）。培育抗病品种仍是防治ToBRFV的最有效手段，但由于含Tm-22基因的材料对ToBRFV 表现为感病，所以急需挖掘针对ToBRFV的抗性基因，用于培育抗ToBRFV 的育种材料。关于ToBRFV 抗性材料筛选及抗性基因克隆的相关研究较少。荷兰安莎公司、法国VILMORIN &CIE公司、荷兰瑞克斯旺集团等都提出了针对ToBRFV培育抗性品种的解决方案（Hamelink et al.，2019；Ashkenazi et al.，2020；Zaden，2020）。荷兰瑞克斯旺集团筛选出3 份有抗性的醋栗番茄（S.pimpinellifolium），并在11、12、6 号染色体上找到了3 个QTL（Hamelink et al.，2019）。这3 个QTL为不完全显性，但将抗病材料与感病材料杂交得到的F1抗性不理想，仍需进一步筛选抗性更加优良的材料。本试验已经获得ToBRFV 感病番茄材料，ToBRFV 的接种体系建立及抗病材料筛选正在进行中。